Блоттинг (от англ. "blot " - пятно) - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация.
- электрофорез в полиакриламидном геле: o в денатурирующих условиях с добавлением мочевины - разделение коротких одноцепочечных НК;
- изоэлектрофокусирование - для разделения белков по изоэлектрической точке (pI);
- двумерный (2D) электрофорез - для разделения белков в двух направлениях - по изоэлектрической точке и по молекулярной массе;
- электрофорез в агарозном геле - разделение НК: o по длине линейных фрагментов;
- тонкослойная хроматография - разделение липидов из липидных комплексов.
o в денатурирующих условиях с добавлением натрия додецилсульфата (электрофорез по Лэммли) - разделение белков по молекулярной массе;
o в нативных условиях - разделение белков по трехмерной структуре;
o по "суперспирализации" кольцевых молекул;
- диффузия молекул - медленный перенос, часто применяется для липидов;
- капиллярный блоттинг - мембрана прижимается к гелю, поверх нее кладется стопка фильтровальной бумаги, буфер для переноса увлажняет гель и поднимается под действием капиллярных сил, смачивая фильтровальную бумагу и перенося макромолекулы из геля на мембрану; капиллярный блоттинг может осуществляться: o в камерах с увлажнением геля буфером - "полусухим" переносом;
- вакуумный блоттинг - аналогичен капиллярному блоттингу, но перенос ускоряется за счет использования вакуума вместо капиллярных сил, создаваемых при смачивании фильтровальной бумаги;
- электроблоттинг - перенос заряженных макромолекул на мембрану происходит под действием электрического тока;
- "пришивание" НК к мембране под действием УФ-облучения или нагрева - для окончательного закрепления на нейлоновых мембранах;
- дот-блоттинг (слот-блоттинг) - нанесение образца производится в виде точки или черточки непосредственно на мембрану без предшествующего разделения молекул в геле или на ТСХ-пластине.
o в камерах с погружением геля в буфер;
- PVDF-мембраны (поливинилиденфторидные);
- NC-мембраны (нитроцеллюлозные);
- нейлоновые мембраны (применяются для НК).
- окрашивание - связывание красителя (ионов серебра, Кумасси, Понсо, этидия бромистого) непосредственно с детектируемыми макромолекулами;
- иммунохимическое мечение - мечение макромолекул происходит за счет специфически связывающихся с ними меченых антител, детекция осуществляется: o иммуноокрашиванием - антитела метятся красителями, регистрируется поглощение света определенной длины волны;
- радиационное мечение - в макромолекулы вводятся радиационные метки (радиоизотопы), детекция осуществляется с помощью: o авторадиографии (наложением на мембрану фотопленки);
- гибридизация - связывание нуклеиновых кислот мечеными олигонуклеотидами с комплементарной структурой, детекция, как правило, осуществляется регистрацией испускания радиационного излучения или флуоресценции метки;
- масс-спектрометрия - используется для прямого структурного анализа липидов.
o иммуноферментно - антитела метятся ферментом, регистрируется количество окрашенного продукта, наработанного в ходе ферментативной реакции (ИФА);
o хемилюминесцентно - антителя метятся репортерным ферментом, который в присутствии субстрата излучает свечение, регистрируется испускание света
определенной длины волны;
o флуоресцентно - антитела метятся флуоресцентной меткой, которая возбуждается светом определенной длины волны, регистрируется испускание света в
более длинноволновой области;
o радиоимаджинга (количественного определения радиационной эмиссии и построения картины взаимного расположения меток);
- Саузерн-блоттинг (блоттинг по Саузерну) - по фамилии Эдвина Саузерна, предложившего метод - определение последовательности ДНК в образце и определение числа копий генов в геномной ДНК. Переносу на мембрану предшествует расщепление образца эндонуклеазами рестрикции на фрагменты и их фракционирование электрофорезом в агарозном геле. Анализ на мембране осуществляется гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами известной последовательности;
- нозерн-блоттинг - определение последовательности РНК в образце и изучение генной экспрессии (определение мРНК). Аналогичен блоттингу по Саузерну, но исследуются выделенные из образца молекулы РНК, без расщепления эндонуклеазами. Разделение молекул проводят в агарозном геле с добавлением формальдегида (для денатурации РНК) или в полиакриламидном геле с добавлением мочевины (применяется для анализа микроРНК). Иммобилизация молекул РНК на мембране происходит за счет нагревания под вакуумом или "пришиванием" с помощью УФ-облучения;
- вестерн-блоттинг - белковый иммуноблоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфических белков в образце. Переносу на мембрану предшествует разделение белков в полиакриламидном геле. Анализ белков на мембране осуществляется иммунохимически;
- фар-вестерн блоттинг - белковый блоттинг, используется для определения белок-белковых взаимодействий, аналогичен вестерн-блоттингу, но вместо антител используются другие белки, специфически связывающиеся с исследуемым белком;
- соузвестерн-блоттинг - определение белков, связывающихся с ДНК, и сайтов в молекулах ДНК, с которыми связываются белки - аналогичен вестерн-блоттингу, но после денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле белки отмываются от натрия додецилсульфата в присутствии мочевины и за счет диффузии переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве пробы используют меченые фрагменты ДНК разной длины, полученные расщеплением более крупного исследуемого фрагмента геномной ДНК. Связавшиеся молекулы ДНК затем вымываются из каждого комплекса белок-ДНК и анализируются электрофорезом в полиакриламидном геле;
- истерн-блоттинг - определение посттрансляционных модификаций белков (связанных с ними липидов, гликополисахаридов, фосфатных остатков) - аналогичен вестерн-блоттингу, но используются антитела не к белкам, а к липидам, гликополисахаридам и т.д. Также в качестве проб используются помимо антител другие белковые молекулы связывающиеся с исследуемыми (например, лектин);
- фар-истерн-блоттинг - анализ липидов, разделенных высокоэффективной тонкослойной хроматографией. Перенос на мембрану, как правило, осуществляется за счет диффузии. Регистрация производится прямым масс-спектрометрическим структурным анализом.
Вестерн - блот (иногда называемый иммуноблот белок ) является широко используемым аналитическим методом используется в молекулярной биологии , иммуногенетики и других молекулярной биологии дисциплин для определения специфических белков в образце гомогената ткани или экстракта.
Вкратце, образец подвергают денатурации белка, а затем гель - электрофореза . Синтетические или животного происхождения антитела (известный в качестве первичного антитела) , который создается распознает и связывается со специфическим белком - мишенью. Электрофорез мембрану промывают в растворе, содержащем первичное антитело, перед тем избыток антитела смывается. Вторичное антитело добавляют, который распознает и связывается с первичным антителом. Вторичное антитело визуализировали с помощью различных методов, таких как окрашивание, иммунофлюоресценции, а также радиоактивности, что позволяет косвенное обнаружение специфического белка - мишени.
Другие родственные методы включают дот - блот анализ, количественную дот - блота , иммуногистохимический и иммуноцитохимию , где антитела используются для обнаружения белков в тканях и клетках иммунной метки и иммуноферментный анализ (ELISA).
Название вестерн - блот это игра на eponymously названием Southern - блот , методика ДНК обнаружения разработан ранее Edwin Southern . Кроме того, обнаружение РНК называют северным кляксу и был разработан Джеймсом Alwine, Дэвид Кемп и Джордж Старк в Стэнфорде . Термин «вестерн - блот» был дан в технике У. Нил Бернетт, хотя сам метод возник в лаборатории Гарри Towbin в .
Приложения
Вестерн - блот широко используется в биохимии для качественного определения одиночных белков и белков-модификаций (например, пост-трансляционной модификации). Он используется в качестве общего метода, чтобы определить наличие определенного одного белка в сложной смеси белков. Полуколичественная оценка белка может быть получена из размера и цвета интенсивности полосы белка на блот - мембране. Кроме того, применение серии разведений очищенного белка известных концентраций может быть использовано, чтобы позволить более точную оценку концентрации белка. Вестерн - блот обычно используется для проверки продукции белка после клонирования . Он также используется в медицинской диагностике, например, в тесте на ВИЧ или BSE -TEST.
Подтверждающий тест на ВИЧ использует вестерн - блот для обнаружения анти-ВИЧ антитела в организме человека в сыворотке образца. Белки из известных ВИЧ -infected клеток разделены и нанесены на мембрану, как описано выше. Затем сыворотка для тестирования применяется в стадии инкубации первичного антитела; свободное антитело вымывает, а вторичное антитело против человеческого связан с сигналом фермента добавляется. Окрашенные полосы затем показывают белки, к которым сыворотка пациента содержит антитело.
Западный блот также используются в качестве окончательного теста для Крейтцфельда-Якоба , типа заболевания приона, связанного с потреблением загрязненной говядины от крупного рогатого скота с бычьей губчатой энцефалопатией (BSE, обычно упоминаются как «коровье бешенство»).
Другое применение в диагностике туляремии. Оценка способности вестерн-блот для выявления антител против F. tularensis показал, что его чувствительность составляет почти 100%, а специфичность 99,6%.
колориметрическое обнаружение
Метод обнаружения колориметрического зависит от инкубации вестерна - блоттинга с субстратом, который взаимодействует с ферментом - репортера (например, пероксидаза) , который связан с вторичным антителом. Это превращает растворимый краситель в нерастворимую форму другого цвета, который выпадает в осадок рядом с ферментом и, таким образом окрашивает мембрану. Развитие блото затем останавливает вымывание растворимой краситель. Уровни белка оценивали с помощью денситометрии (как интенсивное пятно) или спектрофотометрии .
Хемилюминесцентное обнаружение
Хемилюминесцентные методы обнаружения зависит от инкубации вестерн - блоттинга с субстратом, который будет люминесцировать при воздействии репортера на вторичного антитела. Свет затем детектируется ПЗС - камер, которые захвата цифрового изображения на вестерн - блоттинга или фотопленки. Использование пленки для обнаружения Вестерн - блот постепенно исчезает из - за отсутствия линейности изображения (не точной количественной оценки). Изображение анализируется с помощью денситометрии, который оценивает относительное количество белка окрашивания и количественно результаты с точки зрения оптической плотности. Следующее программное обеспечение позволяет дальнейший анализ данных, такие как анализ молекулярного веса, если используются соответствующие стандарты.
Что такое вестерн-блоттинг?
Идентификация белка в сложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.
В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга. Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.
В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
После проведения ДСН - электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы. Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.
После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис. 1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).
Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований. Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос. Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.
Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.
Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал. Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка. Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.
Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А - с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б - первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.
Протокол:
I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков
Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол). Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха. После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.
Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.
II. Электроперенос
Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В. Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте. Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.
III. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране
Для блокирования мест неспецифического связывания антител мембрану инкубируют при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин в PBST (для лучшей блокировки можно использовать раствор PBST, содержащий 10% сухое обезжиренное молоко). После блокировки мембрану инкубируют в течение часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании в PBST, содержащем 1-10 мкг/мл специфичных антител. Оптимальная концентрация антител подбирается эмпирически и зависит от аффинности взаимодействия антител с антигеном. По окончании инкубации мембрану промыть 5 раз PBST и перенести в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Разведение конъюгата обычно указывается производителем на упаковке, либо подбирается исследователем эмпирически. В растворе вторичных антител мембрану инкубировать 1 час при постоянном перемешивании.
После тщательной отмывки (минимум 5 - 6 раз менять буфер) PBST мембрану переносят в раствор хромогенного субстрата, содержащий 3 мг диаминобензидина (ДАБ) и 10 мкл 30% перекиси водорода в 10 мл 0.1 М трис-HCl, рН 7,6. Инкубацию проводят при перемешивании 5 - 10 минут. Мембрану после окончания инкубации с субстратом следует промыть PBST, подсушить, промокнув фильтровальной бумагой, и сразу же сделать электронную копию, сканируя в цвете. Если мембрана полностью высыхает, прокрашенные белковые полосы бледнеют, и изображение получается менее ярким и контрастным.
Примечание: ДАБ является токсичным веществом и потенциальным канцерогеном. Работать только в резиновых перчатках!
Вестерн блоттинг
Профессор кафедры биохимиии молекулярной биологии,
Д.м.н. Спирина Людмила
Викторовна
Вестерн блоттинг
Определение. Вестерн-блоттинг
(вестерн-блот,
аналитический
метод,
используемый для
определения
специфичных
белков в образце.
Определение. Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting)
Определение. Вестерн-блоттинг(вестерн-блот,
белковый иммуноблот, Western bloting)
Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории
Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)
Название вестерн-блот было дано технике У.
Нейлом Бурнеттом и является игрой слов от
названия Саузерн Блоттинг (Southern blotting). методики определения ДНК, разработанной
ранее Эдвином Саузерном
Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)
Western Blotting –метод определения
белков
Саузерн блоттингметодики
определения ДНК,
разработанной
ранее Эдвином
Саузерном Southern
blotting).
Аналогичный метод
определения РНК
называется Нозерн
Блоттинг (Nothern
blotting).
Детекция
посттрансляционных
модификаций белков
называется Истерн
Блоттингом (Eastern
blotting).
протокол. ПРОТОКОЛ
ПРОТОКОЛ1. Разделение белков
методом SDS-PAGE гельэлектрофореза/
С помощью гель-электрофореза
белки разделяются в
полиакриламидном геле.
2. Перенос белков на
мембрану
3. Блокирование и Детекция
Затем их детектируют с
использованием антител:
сначала белки связываются с
первичными (моно- или
поликлональными) антителами,
которые в свою очередь
связываются
со вторичными антителами,
конъюгированными с ферментами
(пероксидазой хрена или
щелочной фосфатазой).
протокол. Вестерн-блоттингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг.
протокол.Вестерн-блоттингом можно обнаруживать
антиген в количествах менее 1нг.
4. Визуализация.
Высокая степень
разрешения достигается за
счет электрофоретического
разделения белков и
специфичности
моноклональных антител.
Визуализация
исследуемого белка
достигается путем
проведения
соответствующей
биохимической реакции с
образованием продукта,
который определяется
колориметрическим,хемилюминесцентным,
флюоресцентным методами
детекции.
5. Анализ.
Количество белка оценивается спомощью денситометрии.
Southern Blotting Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть геном
Геномную ДНК (обычновыделенную из
лейкоцитов или клеток
плода) расщепляют на
короткие фрагменты,
разделяют их в агарозном
геле, переносят на
мембрану, после чего
идентифицируют
специфические участки с
помощью гибридизации с
олигонуклеотидными
зондами.
Nothern Blotting
Аналог Southern Blotting.Этот метод позволяет выявить специфическую
мРНК и оценить ее размер.
Eastern Blotting (является продолжением метода Вестерн блоттинг)
Определение метода Вестерн Блоттинг
Метод основан накомбинации гельэлектрофореза и
иммунохимической
реакции «антигенантитело».
«Твердая фаза» для иммуноблота
пористые материалы типанитроцеллюлозы (PVDF) в виде
наполнителей в объеме или в виде
плоских листов или полосок стрипов
(англ. strip); стрипы используют в
методиках типа иммуноблота и
иммунохроматографии;
в пористых материалах существенно
больше площадь, на которой
сорбирован один из участников
взаимодействия; другие реагенты
диффундируют по порам.
Типы твердой фазы для Вестерн блоттинга
Подготовка образца
Образец может быть взят из цельнойткани или из клеточной культуры. В Цельная ткань
Клеточная культура
большинстве случаев, твёрдые ткани
сначала измельчаются механически
с использованием блендера (для
образцов большого объёма), с
Механическое измельчение
использованием гомогенизатора
(меньшие объемы), или
обработки ультразвуком.
Различные детергенты детергенты,Измельчение гомогенизатором
соли и буферы могут быть
применены для
улучшения лизиса клеток и
растворения белков.
Обработка ультразвуком
Ингибиторы протеаз и фосфатаз част
о добавляются для предотвращения
расщепления образцов их
Измельчение в жидком азоте
собственными ферментами.
Подготовка тканей часто
выполняется при низких
температурах, чтобы
Ингибиторы протеаз, фосфатаз
избежать денатурации белка.
Условия, улучшающие
пробоподготовку
Детергенты, соли, буферы
производит гомогенизацию образцов за счет их встряхивания
в микропробирках или чашах вместе с твердыми шариками
Низкие температуры
Гель-электрофорез. Наиболее распространенный способ разделения белков - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS по Лэмми
Гель-электрофорез. Наиболеераспространенный способ
разделения белков -
электрофорез в
полиакриламидном геле в
присутствии SDS по Лэмми
Гель-электрофорез
Гель-электрофорезSDS вызывает
денатурацию белков
и поддерживает их в
денатурированном
состоянии, для
разрушения
вторичных и
третичных структур
белков используют
восстановители
дисульфидных
связей
Гель -электрофорез
Подлежащиеанализу белки в
присутствии
додецилсульфата
натрия приобретают
одинаковый
отрицательный
заряд, что делает
возможным их
разделение в
зависимости только
от молекулярной
Принцип электрофореза
Предварительноденатурированные белки
вносят в карманы «треков»
(дорожек) акриламидного геля
с низкой концентрацией
(концентрирующий гель), что
позволяет их сконцентрировать
перед переходом в
разделяющий гель (с более
высокой концентрацией), где
происходит разделение белков
в зависимости от молекулярной
массы.
Белки мигрируют в
электрическом поле через
акриламидный гель к аноду,
при этом белки меньшего
размера двигаются быстрее.
Принцип электрофореза
Отличия в скоростипродвижения -
электрофоретической
подвижности приводит к
разделению белков на полосы.
Как правило, одну из
«дорожек» оставляют для
маркеров молекулярной массы
(смеси белков с известными
массами).
Окрашивание гелей
окрашивание белков вгелях красителем
Кумасси
окрашивание белков в
гелях серебром
Для визуализации результатов электрофореза чаще
всего используют окрашивание белков в гелях
красителем Кумасси или серебром
В большинстве случаев результаты
электрофоретического разделения достаточно
получить путем визуальной оценки геля.
Однако, с целью получения достоверных данных и
надлежащего документирования результатов гель
сканируют на просвет при помощи высокочувствительного
денситометра, что позволяет надежно определять не
только положение белков в геле, но и оптическую
плотность белкового пятна.
Окрашивание
мембраны более
надежно
Анализ электрофоретического разделения белков, Блоттинг
С помощью специального программного приложенияможно определить такие параметры как
электрофоретическая подвижность белка, его
чистота, количество белка в пятне и др.
Чаще используют хемилюминесцентную систему
детекции белков – использование рентгеновских пленок
(Блоттинг)
Используют
программное
приложение ImageJ
Применение системы визуализации для WB (см. ниже)
Анализ электрофоретического разделения белков
Определение молекулярной массы исследуемого белкапредполагает необходимость калибровки геля по
молекулярным массам. Калибруют гель относительно
молекулярных масс белков-маркеров, которые
разделяют параллельно с исследуемым образцом.
Выбор % разрешающего геля.
концентрацияакриламида определяет
разрешающую
способность геля - чем
выше концентрация
акриламида, тем лучше
разделение
низкомолекулярных
белков. Низкая
концентрация
акриламида улучшает
разрешающую
способность гельэлектрофореза для
высокомолекулярных
Размер белка, kDa
%AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%
Перенос на мембрану Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изг
Перенос на мембрануЧтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской
геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или PVDF.
Мембрана накладывается поверх геля,
а поверх неё кладут стопку
фильтровальной бумаги.
Метод переноса белков
называется электроблоттингом и
использует электрический ток, который
переносит белки из геля на мембрану.
Белки перемещаются из геля на
мембрану с сохранением своего
расположения. В результате этого
«промакивания» (blotting) процесса
белки удерживаются на тонком
поверхностном слое мембраны для
детекции.
Оба варианта мембран используют изза их свойства неспецифично связывать
белки.
Связывание белков основано как
на гидрофобных взаимодействиях, так
и на электростатических
взаимодействиях между мембраной и
белком.
Нитроцеллюлозная мембрана дешевле
PVDF, но гораздо более хрупкая и хуже
выдерживает повторное нанесение
меток.
Виды электроблоттинга
СухойВлажный
Полусухой
(semidry)
Окрашивание белков на фильтре
Способокраски
Ponceau S
Чувствительность,
количество
белка
1-2µg
Нитроцеллюлоза
+
Нейлон
-
PVDF
+
Amido
Black
1.5µg
+
-
+
Comassie
blue
1.5µg
+
-
+
India ink
100ng
+
-
+
Biotinavidin
30ng
+
+
+
Colloidal
gold
3ng
+
-
+
Окрашивание
обратимое
постоянное, низкий фон
постоянное, высокий фон
постоянное
постоянное, бледнеет со
временем
постоянное
Подтверждение переноса белков на фильтр (окраска Ponceus)
Блокирование
Как только выбранамембрана, выбраны антитела
и целевой белок, должны
быть приняты меры по
исключению взаимодействия
между мембраной и
антителом, используемым для
детекции целевого белка (ибо
антитело само по себе белок).
Блокирование
неспецифичных связываний
достигается помещением
мембраны в разбавленный
раствор белка - обычно это
бычий сывороточный
альбумин или нежирное
сухое молоко или желатин
с небольшим процентом
детергента типа Tween-20.
Блокирование – один из
важных этапов
проведения
эффективного Вестерн
блоттинга
Механизм блокирования
Белокиз разбавленного
раствора прикрепляется к
мембране во всех местах,
где не прикрепился целевой
белок. Поэтому, при
добавлении антител, им
(антителам) нет свободного
места на мембране, куда бы
они могли прикрепиться,
кроме сайтов связывания на
специфичных целевых
белках. Этот фоновый
«шум» в окончательном
продукте вестерн блота
приводит к чистым
результатам и
исключению ложно-
Детекция. Непрямой и прямой WB
преимуществаВторичное антитело усиливает сигнал (несколько вторичных
антител могут связываться с одним первичным)
Имеется широкий выбор вторичных антител
Одно вторичное антитела может быть использовано для
детекции различных специфичных антител
связывание с ферментативной меткой вторичного антитела не
влияет на иммунореактивность первичного антитела
Замена вторичного антитела может способствовать изменению
метода детекции
недостатки
Вторичные антитела способствуют образованию сайтов
неспецифичного связывания
Дополнительные этапы работы
преимущества
необходимость использовать только
первичные антитела, что ускоряет процесс
возможность использовать первичные
антитела с разными метками
Недостатки
связывание с ферментативной меткой
может снижать иммунореактивность
первичного антитела
высокая стоимость первичных антител
проблема выбора антитела и низкий
сигнал
Детекция. Следующим этапом является реакция связывания исследуемого белка со специфическим антителом (первичным).
Раствор антител и мембранамогут быть вместе закрыты и
инкубированы от 30 минут
до оставления на ночь.
Также они могут быть
инкубированы при
различных температурах,
при повышенной
температуре наблюдается
лучшее связывание.
После удаления
несвязавшихся первичных
антител, мембрану
выдерживают со вторичными
антителами и в соответствии
с их целевыми свойствами,
как правило называются по
Антитела для вестерн блоттинга. Механизм детекции.
Антитела получают изживотного источника и
связываются с
большинством первичных
антител. Вторичные
антитела обычно связывают
щелочной фосфатазой или
пероксидазой хрена.
Наиболее
распространенные,
связанные с пероксидазой
хрена вторичные антитела
используются для
разрезания
хемилюминесцентного
агента, и продукт реакции
производит люминесцентное
излучение пропорционально
количеству белка.
Лист светочувствительной
фотографической пленки
помещается напротив мембраны
и подвергается действию
излучения реакции, создавая
изображение полос антител на
блоте.
Более дешевый, но менее
чувствительный подход с
использованием 4хлорнафтольного окрашивания
в смеси с 1 % перекисью
водорода, что дает темнокоричневое окрашивание,
которое регистрируется без
использования специальной
фотографической пленки.
Другой метод детекции
вторичными антителами
использует антитела со
связанным флюорофором,
который излучает в
ближней инфракрасной
области (NIR). Свет,
излучаемый
флюоресцентным
красителем, постоянен и
делает флюоресцентную
детекцию более точным и
чувствительным способом
измерения разницы в
сигнале, производимом
белками, которые мечены
антителами, на вестерн
блоте.
Детекция. Другие методы детекции.
Третий альтернативныйметод использует
радиоактивную метку
вместо фермента,
связанного с вторичным
антителом (с
радиоактивным изотопом
йода). Другие методы
безопаснее, быстрее и
дешевле, поэтому
радиоактивная детекция
используется редко.
Визуализация.
Визуализацияосуществляется с
помощью гельдокументирующих
систем или цифровой
камерой.
Представление фильма
Stain free technologyНа практике, не во всех
вестернах обнаруживают
белки лишь по одному бэнду
на мембране.
Приблизительный размер
вычисляют сравнивая
окрашенные бэнды с
маркерами молекулярной
массы, добавленными при
электрофорезе.
Процесс повторят с
структурными белками,
такими как актин или
тубулин, которые не
меняют между
экспериментами. Количество
целевого белка зависит от
количества контрольного
структурного белка между
группами. Этот прием
обеспечивает коррекцию
количества общего белка на
мембране в случае ошибки
Анализ и представление результатов.
Использованиепрограммного
приложения Image
J.
Программного
приложение BioRadИГХ
Иммунная
флюоресценция
Вестерн
блоттинг
Применение метода
Вестерн-блоттингиспользуется
в молекулярной
биологии, биохимии, гене
тике и в других
естественно-научных
дисциплинах.
В медицине:
диагностика ВИЧ
(СПИД), болезнь
лайма,Helicobacter
Pylori, вирус ЭпштейнБарр
Полный протокол
1. электрофорез2. перенос
3. блокирование
4. инкубация с
первичным антителом
5.отмывка
6.инкубация со
вторичным антителом
7. отмывка
8. обработка
хемилюминесцентной
системой детекции
9. детекция с помощью
рентгеновской пленки
10. анализ
Применение в практической медицине
Подтверждениеинфицированности ВИЧ
Диагностика клещевого
боррелиоза (болезнь Лайма)
Диагностика сибирской язвы
Диагностика токсоплазмоза
(Т);
группу инфекций –
гепатиты, сифилис,
хламидиоз, листериоз и др.
(О);
краснуху (R);
цитомегаловирусную
инфекцию (С);
герпес (Н).
Вирус Эпштейн-Барр
В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены
только
клинически
значимые
антигены
(нативные,
синтетические или рекомбинантные) в определенном
порядке. Такой подход используют для дифференциальной
диагностики нескольких инфекций на одном стрипе
Общие.
1) перенос белка из геля на мембрану;
2) забивка неспецифической сорбции;
3) адсорбция I-антител;
4) отмывка;
5) адсорбция II -антител;
6) отмывка;
7) проявление фильтра;
По пунктам.
Гибридизация.
- Все делать при NT на качающейся платформе, гибридизация и забивка в целлофановых пакетах (V раствора ~1.5мl, в зависимости от размера фильтра), отмывка в ванночке:
- забивка: 3% сухое молоко, 1х PBS, 30-40";
- "I"а/т: 1h 0.3% сухое молоко, 1х PBS, антисыворотка;
- отмывка 3 раза х 5": 1х PBS, 0.05% Tween-20;
- "II"а/т: 30" в 1х PBS;
- отмывка как в п.3.
- Отмывка и забивка проводятся в ванночке. Гибридизация: на стол положить кусок парафильма (больше мембраны), на него - 0.5-1ml гибридизационного раствора с а/т. Положить мембрану стороной (Р) к раствору, избегая пузырей, сверху прикрыть куском парафильма размером с мембрану. Инкубировать 1h.
Несмотря на существенно более низкое содержание сухого молока в гибридизационном буфере для "I"а/т и полное его отсутствие в буфере для "II"а/т этот метод давал чистые картинки. Видимо, успех определялся качеством использованных а/т.
Этот способ сокращает объём гибридизационной смеси, но может ухудшить качество гибридизации.
