Western blot (Western blot, protein immunoblot, Western blot). GPM.1.7.2.0022.15 Imunobiologinių vaistinių preparatų autentiškumo ir grynumo nustatymas Western blot metodu Baltymų identifikavimo metodai Western blot

Blotavimas(iš anglų kalbos dėmė" - dėmė) - NC, baltymų ir lipidų perkėlimas ant kietos atramos, pavyzdžiui, membranos, ir jų imobilizavimas.

Molekulių atskyrimo blotavimui metodai:

• elektroforezė poliakrilamido gelyje:
o denatūravimo sąlygomis pridedant karbamido - trumpų vienos grandinės NA atskyrimas;
o denatūravimo sąlygomis pridedant natrio dodecilsulfato (Laemmli elektroforezė) - baltymų atskyrimas pagal molekulinę masę;
o natūraliomis sąlygomis - baltymų atskyrimas pagal jų trimatę struktūrą;
• izoelektrinis fokusavimas – baltymams atskirti pagal izoelektrinį tašką (pI);
• dvimatė (2D) elektroforezė – baltymams atskirti dviem kryptimis – pagal izoelektrinį tašką ir pagal molekulinę masę;
• agarozės gelio elektroforezė – NC atskyrimas:
o išilgai linijinių fragmentų ilgio;
o žiedo molekulių „superspiralės būdu“;
• plonasluoksnė chromatografija – lipidų atskyrimas nuo lipidų kompleksų.

Perkėlimo būdai:

• molekulių difuzija – lėtas transportas, dažnai naudojamas lipidams;
• kapiliarinis blotavimas - membrana prispaudžiama prie gelio, ant jos uždedamas krūva filtravimo popieriaus, pernešimo buferis sudrėkina gelį ir pakyla, veikiamas kapiliarinių jėgų, sudrėkindamas filtravimo popierių ir perkeldamas makromolekules iš gelio į gelį. membrana; Kapiliarinis blotavimas gali būti atliekamas:
o kamerose su buferiu sudrėkintu geliu - „pusiau sausas“ perkėlimas;
o kamerose su gelio panardinimu į buferį;

• vakuuminis blotavimas – panašus į kapiliarinį blotavimą, tačiau pernešimas paspartinamas naudojant vakuumą, o ne kapiliarines jėgas, susidarančias drėkinant filtravimo popierių;
• elektroblotavimas - įkrautų makromolekulių perkėlimas į membraną vyksta veikiant elektros srovei;
• NC „siuvimas“ prie membranos veikiant UV spinduliuotei arba kaitinant - galutiniam tvirtinimui ant nailono membranų;
• taškinis blotavimas (slot blotting) – mėginys taško arba brūkšnelio pavidalu uždedamas tiesiai ant membranos, prieš tai neatskiriant molekulių gelyje arba ant TLC plokštelės.

Membranų tipai:

• PVDF membranos (polivinilidenfluoridas);
• NC membranos (nitroceliuliozė);
• nailono membranos (naudojamos NDT).

Membranoje esančių makromolekulių žymėjimo ir aptikimo metodai:

• dažymas - dažų (sidabro jonų, Coomassie, Ponceau, etidžio bromido) surišimas tiesiogiai su aptiktomis makromolekulėmis;
• imunocheminis žymėjimas - makromolekulių žymėjimas vyksta dėl žymėtų antikūnų, specifiškai su jais prisijungusių:
o imuninis dažymas - antikūnai žymimi dažais, fiksuojama tam tikro bangos ilgio šviesos sugertis;
o fermentinis imunologinis tyrimas - antikūnai paženklinami fermentu, fiksuojamas fermentinės reakcijos (ELISA) metu susidaręs spalvoto produkto kiekis;
o chemiliuminescencinis - antikūnai yra paženklinti reporterio fermentu, kuris skleidžia švytėjimą esant substratui ir fiksuojama šviesos emisija
tam tikras bangos ilgis;
o fluorescenciniai - antikūnai žymimi fluorescencine žyme, kuri sužadinama tam tikro bangos ilgio šviesa, fiksuojama šviesos emisija
ilgesnio bangos ilgio sritis;
• spinduliuotės žymėjimas - į makromolekules įvedamos spinduliuotės etiketės (radioizotopai), aptikimas atliekamas naudojant:
o autoradiografija (uždedant ant membranos fotojuostos);
o radijo vaizdavimas (kiekybinis spinduliuotės emisijos nustatymas ir santykinės ženklų padėties vaizdo sudarymas);
• hibridizacija - nukleino rūgščių surišimas su pažymėtais oligonukleotidais, turinčiais komplementarią struktūrą, aptikimas, kaip taisyklė, atliekamas registruojant žymės spinduliuotės emisiją arba fluorescenciją;
• masės spektrometrija – naudojama tiesioginei lipidų struktūrinei analizei.

Priimtini blotavimo tipų pavadinimai:

• Southern bloting(Southern blotting) – pavadintas Edvino Southerno vardu, pasiūliusio metodą – DNR sekos nustatymą mėginyje ir geno kopijų skaičių genominėje DNR. Prieš perkėlimą į membraną mėginys suskaidomas restrikcijos endonukleazėmis į fragmentus ir frakcionuojamas elektroforezės būdu agarozės gelyje. Membranos tyrimas atliekamas hibridizuojant su žymėtais žinomos sekos oligonukleotidais;
• Northern bloting- RNR sekos nustatymas mėginyje ir genų ekspresijos tyrimas (mRNR nustatymas). Panašiai kaip Southern blotting, tačiau tiriamos iš mėginio išskirtos RNR molekulės, nevirškinant endonukleazės. Molekulinis atskyrimas atliekamas agarozės gelyje, pridedant formaldehido (denatūruojant RNR) arba poliakrilamido gelyje, pridedant karbamido (naudojamas mikroRNR analizei). RNR molekulių imobilizacija ant membranos atsiranda dėl kaitinimo vakuume arba „kryžminio susiejimo“ naudojant UV spinduliuotę;
• Western blotingas– Baltymų imunoblotingas – tai analitinis metodas, naudojamas konkretiems mėginio baltymams nustatyti. Prieš perkėlimą į membraną baltymai atskiriami poliakrilamido gelyje. Baltymų analizė ant membranos atliekama imunochemiškai;
• tolimojo Vakarų blotingas- baltymų blotavimas, naudojamas baltymų ir baltymų sąveikai nustatyti, panašus į Western bloting, tačiau vietoj antikūnų naudojami kiti baltymai, kurie specifiškai jungiasi su tiriamu baltymu;
• Southern bloting- baltymų, kurie jungiasi su DNR, ir DNR molekulių vietų, prie kurių jungiasi baltymai, nustatymas - panašus į Western blot metodą, tačiau atlikus denatūravimo elektroforezę poliakrilamido gelyje, baltymai nuplaunami iš natrio dodecilsulfato, esant karbamidui ir perkeliami į nitroceliuliozės membrana difuzijos būdu. Kaip pavyzdys naudojami žymėti skirtingo ilgio DNR fragmentai, gauti suskaidžius didesnį tiriamos genominės DNR fragmentą. Tada surištos DNR molekulės išplaunamos iš kiekvieno baltymo-DNR komplekso ir analizuojamos poliakrilamido gelio elektroforeze;
• Rytų blotingas- baltymų posttransliacinių modifikacijų (susijusių lipidų, glikopolisacharidų, fosfatų likučių) nustatymas - panašiai kaip Western blot, bet antikūnai naudojami ne baltymams, o lipidams, glikopolisacharidams ir kt. Be antikūnų, kaip mėginiai taip pat naudojamos kitos baltymų molekulės, kurios jungiasi su tiriamaisiais (pavyzdžiui, lektinas);
• tolimųjų rytų blotingas- lipidų, atskirtų didelio efektyvumo plonasluoksnės chromatografijos būdu, analizė. Perkėlimas į membraną paprastai atliekamas difuzijos būdu. Registracija atliekama tiesiogine masės spektrometrine struktūrine analize.

Western blot(kartais vadinamas imunobloto baltymas klausytis)) yra plačiai naudojamas analizės metodas, naudojamas molekulinės biologijos, imunogenetikos ir kitose molekulinės biologijos srityse, siekiant nustatyti specifinius baltymus audinių homogenate arba ekstrakto mėginyje.

Trumpai tariant, mėginys denatūruojamas, o po to atliekama gelio elektroforezė. Sukurtas sintetinis arba gyvūninės kilmės antikūnas (žinomas kaip pirminis antikūnas) atpažįsta ir jungiasi prie konkretaus tikslinio baltymo. Elektroforezės membrana nuplaunama tirpalu, kuriame yra pirminis antikūnas, prieš nuplaunant antikūnų perteklių. Pridedamas antrinis antikūnas, kuris atpažįsta pirminį antikūną ir prie jo prisijungia. Antrinis antikūnas vizualizuojamas naudojant įvairius metodus, tokius kaip dažymas, imunofluorescencija ir radioaktyvumas, leidžiantis netiesiogiai aptikti specifinį tikslinį baltymą.

Kiti susiję metodai apima dot blot analizę, kiekybinę dot blot analizę, imunohistochemiją ir imunocitochemiją, kai antikūnai naudojami baltymams aptikti audiniuose ir imuninės sistemos ląstelėse, ir su fermentais susietą imunosorbentinį tyrimą (ELISA).

vardas western - blot tai žaidimas su tuo pačiu pavadinimu Southern blot – DNR aptikimo techniką, kurią anksčiau sukūrė Edwinas Southernas. Be to, RNR aptikimas vadinamas Northern blot ir jį sukūrė Jamesas Alwine'as, Davidas Kempas ir George'as Starkas Stanforde. Terminą „Western blot“ technikai suteikė W. Neilas Burnettas, nors pats metodas atsirado Harry Towbino laboratorijoje.

Programos

Western blot yra plačiai naudojamas biochemijoje kokybiniam atskirų baltymų ir baltymų modifikacijų (pavyzdžiui, posttransliacinės modifikacijos) nustatymui. Jis naudojamas kaip bendras metodas nustatyti konkretaus atskiro baltymo buvimą sudėtingame baltymų mišinyje. Pusiau kiekybinį baltymo įvertinimą galima gauti pagal baltymo juostos dydį ir spalvos intensyvumą blot membranoje. Be to, norint tiksliau įvertinti baltymų koncentraciją, galima naudoti žinomų koncentracijų išgrynintų baltymų serijinius skiedimus. Western blot dažniausiai naudojamas baltymų gamybai patikrinti po klonavimo. Jis taip pat naudojamas medicininėje diagnostikoje, pvz., ŽIV testas arba GSE-TEST.

Atliekant patvirtinamąjį ŽIV testą, naudojamas Western blot, siekiant nustatyti antikūnus prieš ŽIV žmogaus serumo mėginyje. Baltymai iš žinomų ŽIV infekuotų ląstelių atskiriami ir uždedami ant membranos, kaip aprašyta aukščiau. Tada tiriamasis serumas taikomas pirminiam antikūnų inkubavimo etapui; laisvas antikūnas išplaunamas ir pridedamas antrinis anti-žmogiškas antikūnas, susietas su fermento signalu. Spalvotos juostos rodo baltymus, prieš kuriuos paciento serume yra antikūnų.

Western blot testas taip pat naudojamas kaip galutinis Creutzfeldt-Jakob ligos, prionų ligos, susijusios su užterštos galvijų, sergančių galvijų spongiformine encefalopatija (GSE, paprastai vadinama „karvių proto liga“), galvijų mėsos vartojimu.

Kitas pritaikymas yra tuliaremijos diagnostika. Įvertinus Western blot gebėjimą aptikti antikūnus prieš F. tularensis, paaiškėjo, kad jo jautrumas buvo beveik 100%, o specifiškumas – 99,6%.

kolorimetrinis aptikimas

Kolorimetrinis aptikimo metodas priklauso nuo Western blot inkubacijos su substratu, kuris sąveikauja su reporterio fermentu (pvz., peroksidaze), kuris yra prijungtas prie antrinio antikūno. Tai paverčia tirpius dažus į netirpią kitos spalvos formą, kuri nusėda šalia fermento ir taip nuspalvina membraną. Tada dėmės vystymasis sustabdomas išplaunant tirpius dažus. Baltymų lygis buvo įvertintas naudojant densitometriją (kaip intensyvią dėmę) arba spektrofotometriją.

Chemiliuminescencinis aptikimas

Chemiliuminescencinio aptikimo metodai priklauso nuo Western blot inkubacijos su substratu, kuris šviečia, kai bus veikiamas antrinio antikūno reporterio. Tada šviesą aptinka CCD kameros, kurios užfiksuoja skaitmeninį vaizdą Western blot arba fotografinėje juostoje. Plėvelės naudojimas Western blot aptikimui palaipsniui nyksta, nes trūksta vaizdo tiesiškumo (netikslaus kiekybinio įvertinimo). Vaizdas analizuojamas naudojant densitometriją, kuri įvertina santykinį baltymų dažymosi kiekį ir kiekybiškai įvertina rezultatus pagal optinį tankį. Ši programinė įranga leidžia atlikti tolesnę duomenų analizę, pvz., molekulinės masės analizę, jei naudojami atitinkami standartai.

Kas yra Western blotting?

Baltymų identifikavimas sudėtinguose įvairių audinių mišiniuose ar ekstraktuose yra viena iš dažnai sutinkamų problemų. Naudojant tokį įrankį kaip specifiniai antikūnai, galima nustatyti tiriamą baltymą su minimaliomis laiko ir finansinėmis sąnaudomis.

Taikant Western blot metodą, pirmajame etape baltymų mišinys atskiriamas elektroforezės būdu, dalyvaujant natrio dodecilsulfatui (SDS), po to perkeliamas į nitroceliuliozės membraną elektroblotavimo būdu. Šio metodo esmė ta, kad po elektroforezės gelis dedamas ant nitroceliuliozės membranos tarp filtravimo popieriaus sluoksnių. Taip surinktas „sumuštinis“ dedamas į elektrinį lauką, kad baltymo-SDS kompleksai judėtų per gelio plokštelę ir būtų imobilizuoti (dėl nespecifinės sorbcijos) ant nitroceliuliozės membranos paviršiaus.

Baltymų-SDS komplekso prisijungimas prie nitroceliuliozės membranos daugiausia apima elektrinio pobūdžio jėgas, o ši sąveika yra daugiataškė ir lemia baltymų „skleidimą“ membranos paviršiuje. Taigi po elektrotransferos gauname nitroceliuliozės gelio kopiją su baltymais, esančiais taip pat, kaip ir poliakrilamido gelyje.

Po SDS elektroforezės, elektropernešimo ir baltymų sorbcijos iš gelio ant nitroceliuliozės membranos, tretinė baltymo konformacija labai pasikeičia, jei apskritai teisinga kalbėti apie tretinės baltymo struktūros egzistavimą po tokio atšiauraus apdorojimo. Todėl imunocheminiam tiriamo baltymo aptikimui dažniausiai naudojami tik mono- arba polikloniniai antikūnai, būdingi baltymo molekulės linijinėms sritims. Antikūnai, specifiniai konformaciniams epitopams (arba sritims, kuriose yra tarpsubvienetų kontaktai), paprastai netinka naudoti Western blot tyrime.

Po baltymų pernešimo membrana paeiliui inkubuojama su tiriamam baltymui specifiniais antikūnais, o po to su antriniais antikūnais, specifiniais pirminių antikūnų Fc fragmentams, konjuguotais su fermento (ar kokio nors kito) žyme (1 pav. A). Tuo atveju, kai tiriamam antigenui būdingi pirminiai antikūnai yra tiesiogiai konjuguoti su etikete, antrinių antikūnų nereikia (1 B pav.). Imuniniai kompleksai, susidarę tiriamo baltymo lokalizacijos vietoje, „pasireiškia“ naudojant chromogeninį substratą (priklausomai nuo etiketės tipo).

Metodo jautrumas ir specifiškumas labai priklauso nuo to, kokie antikūnai naudojami tyrime. Naudojami antikūnai turi būti specifiniai unikaliai aminorūgščių sekai, būdingai tik tiriamam baltymui. Priešingu atveju galima antikūnų sąveika (ypač žalių baltymų ekstraktų atveju) su keliomis baltymų molekulėmis, o tai savo ruožtu lems kelių spalvotų juostų atsiradimą ant membranos. Šiuo atveju tiriamo baltymo nustatymas dažnai būna sunkus arba net neįmanomas.

Antras svarbus veiksnys, į kurį reikia atsižvelgti renkantis antikūnus, yra afinitetas. Kuo didesnis naudojamų antikūnų afinitetas, tuo ryškesnės ir aiškesnės nudažytos baltymų juostos, tuo didesnis metodo jautrumas. Naudojant didelio afiniteto antikūnus, galima pasiekti 1 ng ar net didesnį jautrumą.

Norint vizualizuoti su membrana susieto antigeno ir antikūnų sąveikos rezultatą, naudojami antriniai antikūnai, konjuguoti su agentais, galinčiais tam tikromis sąlygomis duoti tam tikrą signalą. Paprastai kaip toks agentas naudojamas fermentas (peroksidazė arba fosfatazė), kurio reakcijos produktas yra spalvotas ir nusėda ant membranos netirpių nuosėdų pavidalu. Šiuo metodu taip pat galima naudoti fluorescencines etiketes.

Ryžiai. 1. Tiriamo baltymo imunocheminio dažymo schema: A - naudojant antrinius antikūnus, konjuguotus su fermento žyme; B – pirminis antikūnas yra tiesiogiai konjuguotas su fermento žyme.

Protokolas:

I. Gelio ir membranos paruošimas ir baltymų elektrotransfera

Po elektroforezės poliakrilamido gelis dedamas į vonią su blotingo buferiu (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicino, 10 % etanolio). Du filtravimo popieriaus lapai, supjaustyti pagal blotingo kasetės formą ir sudrėkinti blotingo buferiu, dedami ant tos kasetės dalies, kuri bus nukreipta į anodą. Tada ant filtravimo popieriaus dedama nitroceliuliozės membrana, iš anksto sudrėkinta tuo pačiu buferiu, užtikrinant, kad tarp membranos ir popieriaus nebūtų oro burbuliukų. Tada gelį reikia atsargiai uždėti ant membranos, ypatingą dėmesį skiriant tam, kad tarp gelio ir membranos nebūtų oro burbuliukų. Sumuštinio formavimą užbaigia du sudrėkinto filtravimo popieriaus sluoksniai, kurie dedami ant gelio paviršiaus (2 pav.). Gautas sumuštinis įspaudžiamas į kasetę ir dedamas tarp elektrodų taip, kad membrana būtų nukreipta į anodą.

Ryžiai. 2. Baltymų elektros perdavimo į membraną schema.

II. Elektrinis perdavimas

Baltymai perkeliami ant nitroceliuliozės membranos buferyje, kuriame yra 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicino, 10 % etanolio, 30-50 min. esant pastoviai 100 V įtampai. Elektros perdavimo laikas priklauso nuo pernešamus baltymus, kuo didesnis baltymas, tuo ilgiau trunka elektros perdavimas. Elektrotransferos kokybė ir baltymų juostų išsidėstymas vertinamas nitroceliuliozės membraną nudažant 0,3 % Ponceau S tirpalu 1 % acto rūgštyje. Prieš imunocheminį dažymą, membraną reikia keletą kartų nuplauti silpnai šarminiu vandeniniu Tris tirpalu, kad būtų pašalintas su baltymais susijungęs dažiklis.

III. Ant nitroceliuliozės membranos imobilizuotų baltymų imunocheminis dažymas

Norint blokuoti nespecifinio antikūnų surišimo vietas, membrana inkubuojama nuolat maišant kambario temperatūroje 30 minučių PBST (geresniam blokavimui galima naudoti PBST tirpalą, kuriame yra 10 % nugriebto pieno miltelių). Po blokavimo membrana inkubuojama valandą kambario temperatūroje, nuolat maišant PBST, kuriame yra 1-10 μg/ml specifinių antikūnų. Optimali antikūnų koncentracija parenkama empiriškai ir priklauso nuo antikūnų sąveikos su antigenu afiniteto. Inkubavimo pabaigoje membraną 5 kartus nuplaukite PBST ir perkelkite į antrinių antikūnų, konjuguotų su krienų peroksidaze, tirpalą. Konjugato praskiedimą paprastai nurodo gamintojas ant pakuotės arba empiriškai pasirenka tyrėjas. Inkubuokite membraną antrinio antikūno tirpale 1 valandą nuolat maišydami.

Po kruopštaus plovimo (pakeiskite buferį bent 5-6 kartus) PBST membrana perkeliama į chromogeninio substrato tirpalą, kuriame yra 3 mg diaminobenzidino (DAB) ir 10 μl 30% vandenilio peroksido 10 ml 0,1 M Tris-HCl. , pH 7,6. Inkubuojama maišant 5-10 minučių. Pasibaigus inkubacijai su substratu, membraną reikia nuplauti PBST, išdžiovinti filtravimo popieriumi ir nedelsiant nuskaityti spalvotą elektroninę kopiją. Jei membrana visiškai išdžiūsta, nudažytos baltyminės juostelės išblunka, vaizdas tampa ne toks ryškus ir kontrastingas.

Pastaba: DAB yra toksiškas ir galimas kancerogenas. Dirbkite tik su guminėmis pirštinėmis!

Western blotingas

Biochemijos katedros profesorius
ir molekulinė biologija,
medicinos mokslų daktaras Spirina Liudmila
Viktorovna
Western blotingas

Apibrėžimas. Western blotingas
(Western blot,

analitinis
metodas,
naudojama
apibrėžimai
specifinis
baltymų mėginyje.

Apibrėžimas. Western blot (Western blot, baltymų imunoblotas, Western blot)

Apibrėžimas. Western blotingas
(Western blot,
baltymų imunoblotas, Western blot)
Western blot buvo sukurtas laboratorijoje
George'as Starkas (Stenfordas, JK)
W. technikai buvo suteiktas Western blot pavadinimas.
Neilas Burnettas ir yra žodžių žaismas iš
vardai Southern Blotting. sukurti DNR nustatymo metodai
buvęs Edvinas Southernas

Western blotting buvo sukurtas George'o Starko (Stanfordas, JK) laboratorijoje.

Western blotavimas
nustatymo metodas
baltymai
Southern bloting technika
DNR nustatymas,
išvystyta
buvęs Edvinas
Pietų
blotingas).
Panašus metodas
RNR nustatymas
vadinamas Šiaurės
Blotavimas (Nothern
blotingas).
Aptikimas
po vertimo
baltymų modifikacijos
vadinamas Rytų
Blotavimas (Rytų
blotingas).

protokolas. PROTOKOLAS

PROTOKOLAS
1. Baltymų atskyrimas
SDS-PAGE gelio elektroforeze/
Naudojant gelio elektroforezę
baltymai yra suskirstyti į
poliakrilamido gelis.
2. Baltymų perkėlimas į
membrana
3. Blokavimas ir aptikimas
Tada jie aptinkami su
naudojant antikūnus:
baltymai pirmiausia prisijungia prie
pirminis (mono- arba
polikloniniai) antikūnai,
kuris savo ruožtu
kontaktas
su antriniais antikūnais,
konjuguotas su fermentais
( krienų peroksidazė arba
šarminė fosfatazė).

protokolas. Western blot metodu galima aptikti mažiau nei 1 ng antigeno.

protokolas.
Western blot gali aptikti
antigeno kiekis mažesnis nei 1 ng.
4. Vizualizacija.
Aukštas laipsnis
rezoliucija pasiekiama
elektroforezės sąskaita
baltymų atskyrimas ir
specifiškumas
monokloniniai antikūnai.
Vizualizacija
dominantis baltymas
pasiekė
vykdant
tinkamas
biocheminė reakcija su
gaminio formavimas,
kuri yra nustatyta
kolorimetrinė, chemiliuminescencinė,
fluorescenciniai metodai
aptikimas.

5. Analizė.

Baltymų kiekis apskaičiuojamas nuo
naudojant densitometriją.

Southern Blotting Šis metodas identifikuoja unikalius DNR fragmentus, kurie yra maždaug viena milijoninė genomo dydžio.

Genominė DNR (paprastai
išgautas iš
leukocitų ar ląstelių
vaisius) yra padalintas į
trumpi fragmentai,
atskirkite juos agarozėje
gelis, perkeltas į
membrana, tada
nustatyti
konkrečiose srityse su
naudojant hibridizaciją su
oligonukleotidas
zondai.

Northern Blotting

Panašus į Southern Blotting.
Šis metodas leidžia mums nustatyti konkrečius
mRNR ir įvertinti jos dydį.

Rytų blotingas (Western blotting metodo tęsinys)

Western Blotting metodo apibrėžimas

Metodas pagrįstas
gelio elektroforezės deriniai ir
imunocheminis
antigenų ir antikūnų reakcijos.

„Kietoji fazė“ imunoblotingui

porėtos medžiagos tipas
nitroceliuliozės (PVDF) pavidalu
užpildai tūrio ar formos
plokšti lakštai ar juostelės
(angliška juostelė); naudojamos juostelės
metodai, tokie kaip imunoblotingas ir
imunochromatografija;
porėtose medžiagose tai būtina
didesnis plotas, ant kurio
vienas iš dalyvių yra sorbuotas
sąveikos; kiti reagentai
pasklinda per poras.

Kietosios fazės tipai Western blotavimui

Mėginio paruošimas

Mėginį galima paimti iš visumos
audinių arba iš ląstelių kultūros. B Pilnas audinys
Ląstelių kultūros
daugeliu atvejų kietieji audiniai
pirmiausia sutraiškytas mechaniškai
naudojant maišytuvą (skirta
didelio tūrio mėginiai), su
Mechaninis šlifavimas
naudojant homogenizatorių
(mažesni kiekiai), arba
ultragarsinis gydymas.
Įvairūs plovikliai, plovikliai, Šlifavimas homogenizatoriumi
druskos ir buferiai gali būti
taikomas
pagerinti ląstelių lizę ir
baltymų tirpimas.
Ultragarsinis gydymas
Dažnai vartojami proteazės ir fosfatazės inhibitoriai
o pridedami siekiant užkirsti kelią
dalijant jų pavyzdžius
Šlifavimas skystame azote
savų fermentų.
Dažnas audinių paruošimas
atliekama žemai
temperatūros iki
Proteazės ir fosfatazės inhibitoriai
vengti baltymų denatūravimo.
Sąlygos, kurios gerėja
mėginio paruošimas
Plovikliai, druskos, buferiai
homogenizuoja mėginius juos purtant
mikrovamzdeliuose ar dubenyse kartu su kietais rutuliais
Žemos temperatūros

Gelio elektroforezė. Labiausiai paplitęs baltymų atskyrimo metodas yra poliakrilamido gelio elektroforezė naudojant SDS pagal Lammy.

Gelio elektroforezė. Dauguma
bendras metodas
baltymų atskyrimas -
elektroforezė į
poliakrilamido gelis viduje
SDS buvimas pagal Lammy

Gelio elektroforezė

Gelio elektroforezė
SDS skambučiai
baltymų denatūravimas
ir palaiko juos
denatūruotas
sąlyga, už
sunaikinimas
antrinis ir
tretinės struktūros
naudojami baltymai
reduktorius
disulfidas
jungtys

Gelio elektroforezė

Tema
baltymų analizė
buvimas
dodecilo sulfatas
natrio padidėjimas
tas pats
neigiamas
apmokestinti ką daro
galimi jie
padalijimas į
tik priklausomybes
iš molekulinės

Elektroforezės principas

Anksčiau
denatūruotų baltymų
įdėti į "takelių" kišenes
(takų) akrilamido gelis
su maža koncentracija
(koncentruojantis gelis), kad
leidžia juos sutelkti
prieš persikeliant į
atskyrimo gelis (su daugiau
didelė koncentracija), kur
vyksta baltymų atskyrimas
priklausomai nuo molekulinės
masės.
Baltymai migruoja į
elektrinis laukas per
akrilamido gelis prie anodo,
o baltymai mažesni
dydis juda greičiau.

Elektroforezės principas

Greičio skirtumai
akcijos -
elektroforezinis
mobilumas veda prie
baltymų atskyrimas į juostas.
Kaip taisyklė, vienas iš
„takeliai“ paliekami
molekulinės masės žymenys
(baltymų mišiniai su žinoma
masės).

Dažymo geliai

baltymų dažymas
geliai su dažais
Coomassie
baltymų dažymas
sidabro geliai
Norėdami dažniau vizualizuoti elektroforezės rezultatus
Paprastai naudojamas baltymų dažymas gelyje
Coomassie dažai arba sidabras

Daugeliu atvejų rezultatai
pakanka elektroforetinio atskyrimo
gautas vizualiai įvertinus gelį.
Tačiau norint gauti patikimus duomenis ir
tinkamas gelio rezultatų dokumentavimas
nuskaityta per perdavimą naudojant labai jautrų
densitometras, leidžiantis patikimai nustatyti
tik baltymų padėtis gelyje, bet ir optinė
baltyminės dėmės tankis.
Dažymas
membranų daugiau
patikimai

Baltymų elektroforetinio atskyrimo analizė, blotavimas

Naudojant specialią programinę įrangą
galite apibrėžti tokius parametrus kaip
elektroforezinis baltymo mobilumas, jo
grynumas, baltymų kiekis dėmėje ir kt.
Dažniausiai naudojama chemiliuminescencinė sistema
baltymų aptikimas – rentgeno filmų naudojimas
(Blotingas)
Naudokite
programinė įranga
ImageJ programa

WB vizualizacijos sistemos taikymas (žr. toliau)

Elektroforetinio baltymų atskyrimo analizė

Tiriamo baltymo molekulinės masės nustatymas
rodo, kad reikia kalibruoti gelį pagal
molekulinės masės. Kalibruokite gelį, palyginti su
baltymų žymenų molekulinės masės, kurios
atskirti lygiagrečiai su tiriamuoju pavyzdžiu.

% tirpstančio gelio pasirinkimas.

koncentracija
akrilamidas nustato
leidžiantis
gelio gebėjimas - nei
didesnė koncentracija
akrilamidas, tuo geriau
atskyrimas
mažos molekulinės masės
baltymai. Žemas
koncentracija
akrilamidas gerina
leidžiantis
gelio elektroforezės galimybė
didelės molekulinės masės
Baltymų dydis, kDa
%AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%

Perkėlimas į membraną Kad baltymai būtų prieinami antikūnams ir tolesniam aptikimui, jie kartu su gelio juostele perkeliami į membraną, išspaudžiami.

Perkelkite į membraną
Kad baltymai būtų prieinami antikūnams ir tolesniam aptikimui, jie sujungiami su juostele
Gelis perkeliamas į membraną, pagamintą iš nitroceliuliozės arba PVDF.
Membrana uždedama ant gelio,
o ant jo dedamas rietuvė
filtravimo popierius.
Baltymų perdavimo būdas
vadinamas elektroblotingu ir
naudoja elektros srovę, kuri
perneša baltymus iš gelio į membraną.
Baltymai juda iš gelio į
membrana išlaikant ją
vieta. Kaip rezultatas
"blotingo" procesas
baltymai laikomi ploni
membranos paviršinis sluoksnis
aptikimas.
Abu membranų variantai naudojami dėl jų nespecifinių surišimo savybių.
baltymai.
Surišimas su baltymais pagrįstas abiem
dėl hidrofobinės sąveikos, taigi
ir ant elektrostatinės
sąveika tarp membranos ir
baltymas.
Nitroceliuliozės membrana yra pigesnė
PVDF, bet daug trapesnis ir blogesnis
atlaiko pakartotinį naudojimą
ženklų.

Elektroblotavimo tipai

Sausas
Šlapias
Pusiau sausas
(pusiau sausas)

Baltymų dažymas ant filtro

Būdas
spalvinimas
Ponceau S
Jautrumas,
kiekis
voverė
1-2 µg
Nitroceliuliozė
+
Nailonas
-
PVDF
+
Amido
Juoda
1,5 µg
+
-
+
Comassie
mėlyna
1,5 µg
+
-
+
Indijos rašalas
100 ng
+
-
+
Biotinavidinas
30 ng
+
+
+
Koloidinis
auksas
3ng
+
-
+
Dažymas
grįžtamasis
pastovus, žemas fonas
pastovus, aukštas fonas
nuolatinis
nuolatinis, blunka su
laikas
nuolatinis

Baltymų pernešimo į filtrą patvirtinimas (Ponceus dėmė)

Blokavimas

Pasirinkus
membrana, atrinkti antikūnai
o tikslinis baltymas turėtų
bus imtasi priemonių
vengti sąveikos
tarp membranos ir
naudojami antikūnai
tikslinio baltymo aptikimas (nes
antikūnas pats yra baltymas).
Blokavimas
nespecifiniai surišimai
pasiektas kambariu
membranos praskiestos
baltymų tirpalas – dažniausiai tai
galvijų išrūgos
albumino arba liesos
pieno miltelių arba želatinos
su nedideliu procentu
ploviklio tipas Tween-20.
Blokavimas yra vienas iš
svarbius etapus
vykdant
veiksmingas vakarietiškas
blotingas

Užrakinimo mechanizmas

Baltymas
nuo praskiestų
tirpalas pridedamas
membrana visose vietose,
kur taikinys nepritvirtintas
baltymas. Todėl kai
pridedant antikūnus
(antikūnai) laisvų nėra
vietų ant membranos, bet kur
jie galėjo prisirišti
išskyrus surišimo vietas
konkretus tikslas
voverės Šis fonas
„triukšmas“ finale
Western blot produktas
veda į švarą
rezultatus ir
išskyrus netikrą

Aptikimas. Netiesioginis ir tiesioginis WB

privalumų
Antrinis antikūnas sustiprina signalą (keli antriniai
antikūnai gali prisijungti prie vieno pirminio)
Galimas platus antrinių antikūnų asortimentas
Galima naudoti vieną antrinį antikūną
įvairių specifinių antikūnų aptikimas
prisijungimas prie antrinio antikūno fermentinio žymens nėra
veikia pirminio antikūno imunoreaktyvumą
Antrinio antikūno pakeitimas gali prisidėti prie pokyčių
aptikimo metodas
trūkumai
Antriniai antikūnai skatina vietos susidarymą
nespecifinis surišimas
Papildomi darbo žingsniai
privalumų
reikia naudoti tik
pirminių antikūnų, o tai pagreitina procesą
gebėjimas naudoti pirminį
antikūnai su skirtingomis etiketėmis
Trūkumai
prisijungimas prie fermentinės žymės
gali sumažinti imunoreaktyvumą
pirminis antikūnas
didelė pirminių antikūnų kaina
antikūnų atrankos problema ir mažas
signalas

Aptikimas. Kitas žingsnis – tiriamo baltymo jungimosi reakcija su specifiniu antikūnu (pirminis).

Antikūnų tirpalas ir membrana
galima uždaryti kartu ir
inkubuojamas 30 minučių
prieš išvykstant nakčiai.
Jie taip pat gali būti
inkubuojamas prie
skirtingos temperatūros,
su padidinta
stebima temperatūra
geresnis įrišimas.
Po pašalinimo
nesurištas pirminis
antikūnai, membrana
atlaikyti su antrine
antikūnų ir pagal
su jų tikslinėmis savybėmis,
dažniausiai skambina

Antikūnai Western blotting. Aptikimo mechanizmas.

Antikūnai gaunami iš
gyvulinis šaltinis ir
kontaktas
dauguma pirminių
antikūnų. Antrinis
antikūnai paprastai jungiasi
šarminės fosfatazės arba
krienų peroksidazė.
Dauguma
bendras,
susijęs su peroksidaze
krienų antriniai antikūnai
naudojama
pjaustymas
chemiliuminescencinis
agentas ir reakcijos produktas
gamina liuminescencines
spinduliuotė yra proporcinga
baltymų kiekis.
Lakštas jautrus šviesai
fotografinis filmas
dedamas priešais membraną
ir yra veikiamas
reakcijos spinduliuote, kuriant
antikūnų juostų vaizdas
dėmė.
Pigiau, bet mažiau
jautrus požiūris su
naudojant 4-chlornaftolio dažymą
sumaišyti su 1% peroksidu
vandenilis, kuris suteikia tamsiai rudą spalvą,
kuri registruota be
specialių
fotografinis filmas.

Kitas aptikimo būdas
antriniai antikūnai
naudoja antikūnus su
surištas fluoroforas,
kuris išspinduliuoja
šalia infraraudonųjų spindulių
plotas (NIR). šviesa,
skleidžiama
fluorescencinė
dažai, permanentiniai ir
daro fluorescencinę
aptikimas tikslesnis ir
jautriu būdu
matuojant skirtumą
sukurtas signalas
baltymai, kurie yra pažymėti
Vakarų antikūnai
dėmė.

Aptikimas. Kiti aptikimo metodai.

Trečia alternatyva
metodų naudojimo
radioaktyvus žymeklis
vietoj fermento
siejamas su antrine
antikūnų (su
radioaktyvusis izotopas
jodas). Kiti metodai
saugiau, greičiau ir
todėl pigiau
radioaktyviųjų medžiagų aptikimas
retai naudojamas.

Vizualizacija.

Vizualizacija
atlikta su
gelio dokumentacijos pagalba
sistemos arba skaitmeninės
fotoaparatas.

Filmo pristatymas

Technologija be dėmių

Praktiškai ne visuose
Atrandami vesternai
baltymai tik vienoje juostoje
ant membranos.
Apytikslis dydis
apskaičiuokite lygindami
dažytos juostos su
molekuliniai žymenys
mišios pridėtos prie
elektroforezė.
Procesas bus kartojamas su
struktūriniai baltymai,
pavyzdžiui, aktino arba
tubulino, kurių nėra
keisti tarp
eksperimentai. Kiekis
tikslinis baltymas priklauso nuo
kontrolinis kiekis
struktūrinis baltymas tarp
grupėse. Ši technika
suteikia korekciją
bendro baltymų kiekio vienam
membrana klaidos atveju

Rezultatų analizė ir pristatymas.

Naudojimas
programinė įranga
Vaizdo programos
J.
Programinė įranga
BioRad programa

IHC
Imuninis
fluorescencija
Vakarų
blotingas

Metodo taikymas

Western blotingas
naudojamas
molekulinėje
biologija, biochemija, genai
tika ir kt
gamtos mokslai
disciplinas.
Medicinoje:
ŽIV diagnozė
(AIDS), liga
kalkės, Helicobacter
Pylori, Epstein Barr virusas

Pilnas protokolas

1. elektroforezė
2. perkėlimas
3. blokavimas
4. inkubacija su
pirminis antikūnas
5.plovimas
6.inkubacija su
antrinis antikūnas
7. plovimas
8. apdorojimas
chemiliuminescencinis
aptikimo sistema
9. aptikimas naudojant
rentgeno filmas
10. analizė

Taikymas praktinėje medicinoje

Patvirtinimas
ŽIV infekcija
Erkių platinamų ligų diagnostika
boreliozė (Laimo liga)
Juodligės diagnozė
Toksoplazmozės diagnozė
(T);
infekcijų grupė -
hepatitas, sifilis,
chlamidijos, listeriozė ir kt.
(Apie);
raudonukė (R);
citomegalovirusas
infekcija (C);
pūslelinė (H).
Epstein-Barr virusas
Šiuo atveju bandymo juostelių membranos yra padengtos
tik
kliniškai
reikšmingas
antigenai
(gimtoji,
sintetinis arba rekombinantinis) tam tikrame
Gerai. Šis metodas naudojamas diferencijavimui
diagnozuoti kelias infekcijas vienoje juostelėje

Yra dažni.

Visi Vakarų scenos metodai susideda iš šių žingsnių:

1) baltymų perkėlimas iš gelio į membraną;
2) nespecifinės sorbcijos blokavimas;
3) I-antikūnų adsorbcija;
4) plovimas;
5) II-antikūnų adsorbcija;
6) plovimas;
7) filtrų kūrimas;

Kokio tipo membraną naudoti: NC ar PVDV (jie sako, kad pastaroji jautresnė), priklauso tik nuo jūsų skonio. NC membrana yra trapesnė, tačiau atsargiai naudojant tai nepastebima.

Taškai.

Ar apipjaustyti gelį, paliekant tik tą plotą, kurį norite matyti paveikslėlyje prieš perkėlimą, po perkėlimo, ar visai nekarpyti, priklauso nuo jūsų noro išsaugoti membraną ir antikūnus.

Galima atlikti gelio vonelėje.

Bet geriau viską tepti iš karto be burbuliukų.

Arba ~3mA vienai atskirai juostelei.

Kartais pravartu pažymėti gelio ribų, šulinių ir kt.

Galite kontroliuoti, kiek baltymų lieka gelyje po perkėlimo, dažydami gelį.

Hibridizacija.

Filtras visada turi būti šlapias.

Išdžiūvusią PVDF membraną reikia sudrėkinti metanoliu.

P pusė (į kurią buvo perkelta) turi liestis su tirpalu.

Hibridizacija su a/t atliekama hibridizatoriuje 26 o C temperatūroje mažuose cilindruose arba 50 ml CF mėgintuvėliuose. Hibridizacijos tirpalo tūris ~3ml (kuo minimalus, bet kad membrana neišdžiūtų).

Plovimas ir užpildymas: su NT, kratymas vonioje (dangtelis nuo tipų) V = 30-50ml.

Arba išmeskite tirpalą arba atlikite hibridizaciją jame, tik nepilkite koncentruoto a/t ant filtro.

Nespecifinėms medžiagoms įdarui geriausia naudoti pieno miltelius (galima ir BSA, bet mes mažiau mėgstame). Skirtingos partijos šiek tiek skiriasi fono intensyvumu.

Supilkite hibridizacijos tirpalą į 50ml CF mėgintuvėlį, įpilkite reikiamą kiekį a/t, išmaišykite. Padėkite filtrą išilgai mėgintuvėlio sienelės ir įdėkite į hibridizatorių.

Jei nežinote, kokiu skiedimu veikia a/t, turėsite tai nustatyti eksperimentiškai.

Sąveikos su antikūnais laikas gali būti padidintas arba sutrumpintas, priklausomai nuo jūsų antikūnų.

Hibridizacija atliekama 0,1-0,15M NaCl, jonų stiprumo sumažėjimas sukelia stiprią nespecifinę hibridizaciją.

Labai svarbus!!! Tirpalas su antikūnais gali būti naudojamas kelis kartus (5-7). Panaudojus pakanka užšaldyti -20 o C. Ši procedūra veikia bent jau hibridizacijos buferiui: 1x PBS (be Mg++/Ca++), 0,3-1,0% Sausas pienas, Antikūnai.

Atliekant imuninį dažymą po imunoprecipitacijos, foną galima pašalinti iš anksto konjuguojant antrinius antikūnus su pirminiais.

Pateikta procedūra nėra vienintelė. Galimybės:

1. Viską daryti su NT ant siūbuojamosios platformos, hibridizacija ir pakavimas į plastikinius maišelius (V tirpalas ~1,5ml, priklausomai nuo filtro dydžio), plovimas vonioje:
1. įdaras: 3% pieno miltelių, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1h 0,3% pieno milteliai, 1x PBS, antiserumas;
3. skalbti 3 kartus x 5": 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. "II"a/t: 30" 1x PBS;
5. skalbimas, kaip nurodyta 3 veiksme.

Nepaisant žymiai mažesnio sauso pieno kiekio hibridizacijos buferyje „I“ a/t ir visiško jo nebuvimo buferyje „II“ a/t, šis metodas davė aiškius vaizdus. Matyt, sėkmę lėmė naudotų transporto priemonių kokybė.

2. Skalbimas ir užpildymas atliekamas vonioje. Hibridizacija: ant stalo uždėkite parafilmo gabalėlį (didesnį nei membrana), o ant jo - 0,5-1 ml hibridizacijos tirpalo su a/t. Padėkite membraną puse (P) į tirpalą, vengdami burbuliukų, o viršų uždenkite membranos dydžio parafilmu. Inkubuoti 1 val.

Šis metodas sumažina hibridizacijos mišinio tūrį, tačiau gali pabloginti hibridizacijos kokybę.

Maksimalus švytėjimas atsiranda 4-5" užtepus tirpalą (protingas švytėjimo intensyvumas išlaikomas 15-20").