Western blotting (Western blot, protein imunoblot, Western blotting). GPM.1.7.2.0022.15 Penentuan keaslian dan kemurnian produk obat imunobiologis menggunakan metode Western blot Metode identifikasi protein Western blot

noda(dari bahasa Inggris " aib" - spot) - transfer NC, protein, dan lipid ke bahan pendukung padat, misalnya membran dan imobilisasinya.

Metode pemisahan molekul untuk blotting:

• elektroforesis dalam gel poliakrilamida:
o dalam kondisi denaturasi dengan penambahan urea - pemisahan NA rantai tunggal pendek;
o dalam kondisi denaturasi dengan penambahan natrium dodesil sulfat (elektroforesis Laemmli) - pemisahan protein berdasarkan berat molekul;
o dalam kondisi asli - pemisahan protein menurut struktur tiga dimensinya;
• pemfokusan isoelektrik - untuk memisahkan protein berdasarkan titik isoelektrik (pI);
• elektroforesis dua dimensi (2D) - untuk memisahkan protein dalam dua arah - berdasarkan titik isoelektrik dan berat molekul;
• elektroforesis gel agarosa - pemisahan NC:
o sepanjang fragmen linier;
o dengan “supercoiling” molekul cincin;
• kromatografi lapis tipis - pemisahan lipid dari kompleks lipid.

Metode Transfer:

• difusi molekul - transportasi lambat, sering digunakan untuk lipid;
• blotting kapiler - membran ditekan ke gel, setumpuk kertas saring ditempatkan di atasnya, buffer transfer membasahi gel dan naik di bawah aksi gaya kapiler, membasahi kertas saring dan mentransfer makromolekul dari gel ke gel. selaput; blotting kapiler dapat dilakukan:
o dalam ruang dengan gel yang dibasahi dengan buffer - transfer “semi-kering”;
o di ruang dengan perendaman gel dalam buffer;

• blotting vakum - mirip dengan blotting kapiler, tetapi transfer dipercepat dengan menggunakan ruang hampa, bukan gaya kapiler yang dihasilkan dengan membasahi kertas saring;
• electroblotting - transfer makromolekul bermuatan ke membran terjadi di bawah pengaruh arus listrik;
• “menjahit” NC ke membran di bawah pengaruh iradiasi UV atau pemanasan - untuk fiksasi akhir pada membran nilon;
• dot blotting (slot blotting) - sampel diaplikasikan dalam bentuk titik atau garis langsung pada membran tanpa terlebih dahulu memisahkan molekul dalam gel atau pada pelat KLT.

Jenis membran:

• Membran PVDF (polivinilidena fluorida);
• Membran NC (nitroselulosa);
• membran nilon (digunakan untuk NDT).

Metode pelabelan dan deteksi makromolekul pada membran:

• pewarnaan - pengikatan pewarna (ion perak, Coomassie, Ponceau, etidium bromida) langsung ke makromolekul yang terdeteksi;
• pelabelan imunokimia - pelabelan makromolekul terjadi karena antibodi berlabel yang secara khusus mengikatnya, deteksi dilakukan:
o immunostaining - antibodi diberi label dengan pewarna, penyerapan cahaya dengan panjang gelombang tertentu dicatat;
o immunoassay enzim - antibodi diberi label dengan enzim, jumlah produk berwarna yang dihasilkan selama reaksi enzimatik (ELISA) dicatat;
o chemiluminescent - antibodi diberi label dengan enzim reporter, yang memancarkan cahaya ketika ada substrat, dan emisi cahaya dicatat
panjang gelombang tertentu;
o fluoresen - antibodi diberi label dengan label fluoresen, yang tereksitasi oleh cahaya dengan panjang gelombang tertentu, emisi cahaya dicatat dalam
wilayah dengan panjang gelombang yang lebih panjang;
• pelabelan radiasi - label radiasi (radioisotop) dimasukkan ke dalam makromolekul, deteksi dilakukan dengan menggunakan:
o autoradiografi (dengan menerapkan film fotografi pada membran);
o pencitraan radio (penentuan kuantitatif emisi radiasi dan membuat gambaran posisi relatif tanda);
• hibridisasi - pengikatan asam nukleat dengan oligonukleotida berlabel dengan struktur pelengkap, deteksi, biasanya dilakukan dengan mencatat emisi radiasi atau fluoresensi label;
• spektrometri massa - digunakan untuk analisis struktur lipid secara langsung.

Nama yang diterima untuk jenis blotting:

• Blot Selatan(Southern blotting) - dinamai Edwin Southern, yang mengusulkan metode - menentukan urutan DNA dalam sampel dan menentukan jumlah salinan gen dalam DNA genom. Pemindahan ke membran didahului dengan pencernaan sampel dengan restriksi endonuklease menjadi fragmen dan fraksinasinya dengan elektroforesis dalam gel agarosa. Uji membran dilakukan dengan hibridisasi dengan oligonukleotida berlabel dengan urutan yang diketahui;
• Blot utara- Penentuan urutan RNA dalam sampel dan studi ekspresi gen (penentuan mRNA). Mirip dengan Southern blotting, tetapi molekul RNA yang diisolasi dari sampel diperiksa, tanpa pencernaan endonuklease. Pemisahan molekuler dilakukan dalam gel agarosa dengan penambahan formaldehida (untuk mendenaturasi RNA) atau dalam gel poliakrilamida dengan penambahan urea (digunakan untuk analisis mikroRNA). Imobilisasi molekul RNA pada membran terjadi karena pemanasan dalam kondisi vakum atau “ikatan silang” menggunakan iradiasi UV;
• blotting barat- Imunoblotting protein adalah metode analisis yang digunakan untuk mengidentifikasi protein spesifik dalam sampel. Transfer ke membran didahului dengan pemisahan protein dalam gel poliakrilamida. Analisis protein pada membran dilakukan secara imunokimia;
• blotting barat jauh- protein blotting, digunakan untuk menentukan interaksi protein-protein, mirip dengan Western blotting, tetapi alih-alih antibodi, digunakan protein lain yang secara khusus mengikat protein yang diteliti;
• Blot Selatan- penentuan protein yang mengikat DNA dan situs dalam molekul DNA yang mengikat protein - mirip dengan Western blotting, tetapi setelah denaturasi elektroforesis dalam gel poliakrilamida, protein dicuci dari natrium dodesil sulfat dengan adanya urea dan dipindahkan ke a membran nitroselulosa secara difusi. Sebagai sampel, digunakan fragmen DNA berlabel dengan panjang berbeda, yang diperoleh dengan membelah fragmen DNA genom yang lebih besar yang diteliti. Molekul DNA yang terikat kemudian dibersihkan dari setiap kompleks protein-DNA dan dianalisis dengan elektroforesis gel poliakrilamida;
• Blot Timur- penentuan modifikasi protein pasca-translasi (lipid terkait, glikopolisakarida, residu fosfat) - mirip dengan Western blotting, tetapi antibodi digunakan bukan terhadap protein, tetapi terhadap lipid, glikopolisakarida, dll. Selain antibodi, molekul protein lain yang mengikat subjek uji (misalnya lektin) juga digunakan sebagai sampel;
• blotting timur jauh- analisis lipid dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi. Transfer ke membran biasanya dilakukan melalui difusi. Registrasi dilakukan dengan analisis struktur spektrometri massa langsung.

noda barat(kadang-kadang dipanggil protein imunoblot mendengarkan)) adalah metode analisis yang banyak digunakan dalam biologi molekuler, imunogenetika, dan disiplin biologi molekuler lainnya untuk menentukan protein spesifik dalam homogenat jaringan atau sampel ekstrak.

Singkatnya, sampel mengalami denaturasi protein dan kemudian elektroforesis gel. Antibodi sintetik atau yang berasal dari hewan (dikenal sebagai antibodi primer) yang dibuat mengenali dan mengikat protein target tertentu. Membran elektroforesis dicuci dalam larutan yang mengandung antibodi primer sebelum kelebihan antibodi dibersihkan. Antibodi sekunder ditambahkan yang mengenali dan mengikat antibodi primer. Antibodi sekunder divisualisasikan menggunakan berbagai metode seperti pewarnaan, imunofluoresensi, dan radioaktivitas, yang memungkinkan deteksi tidak langsung terhadap protein target spesifik.

Metode terkait lainnya termasuk analisis dot blot, analisis dot blot kuantitatif, imunohistokimia, dan imunositokimia, di mana antibodi digunakan untuk mendeteksi protein dalam jaringan dan sel label imun, dan uji imunosorben terkait enzim (ELISA).

Nama barat - noda ini adalah plesetan dari Southern blot yang berjudul eponymous, teknik deteksi DNA yang sebelumnya dikembangkan oleh Edwin Southern. Selain itu, deteksi RNA disebut Northern Blot dan dikembangkan oleh James Alwine, David Kemp dan George Stark di Stanford. Istilah "Western blot" diberikan pada teknik ini oleh W. Neil Burnett, meskipun metode itu sendiri berasal dari laboratorium Harry Towbin.

Aplikasi

Western blot banyak digunakan dalam biokimia untuk penentuan kualitatif protein tunggal dan modifikasi protein (misalnya, modifikasi pasca-translasi). Ini digunakan sebagai metode umum untuk menentukan keberadaan protein tunggal tertentu dalam campuran protein yang kompleks. Perkiraan semikuantitatif suatu protein dapat diperoleh dari ukuran dan intensitas warna pita protein pada membran blot. Selain itu, penggunaan pengenceran serial protein murni dengan konsentrasi yang diketahui dapat digunakan untuk memungkinkan perkiraan konsentrasi protein yang lebih akurat. Western blot biasanya digunakan untuk memeriksa produksi protein setelah kloning. Ini juga digunakan dalam diagnostik medis, seperti tes HIV atau TES BSE.

Tes konfirmasi HIV menggunakan Western blot untuk mendeteksi antibodi anti-HIV dalam sampel serum seseorang. Protein dari sel yang diketahui terinfeksi HIV dipisahkan dan diaplikasikan pada membran seperti dijelaskan di atas. Serum pengujian kemudian diterapkan pada langkah inkubasi antibodi primer; antibodi bebas dihilangkan, dan antibodi anti-manusia sekunder yang digabungkan dengan sinyal enzim ditambahkan. Pita berwarna kemudian menunjukkan protein yang mengandung antibodi dalam serum pasien.

Western blot juga digunakan sebagai tes pasti untuk penyakit Creutzfeldt-Jakob, sejenis penyakit prion yang terkait dengan konsumsi daging sapi yang terkontaminasi dengan bovine spongiform encephalopathy (BSE, biasa disebut sebagai "penyakit sapi gila").

Aplikasi lainnya adalah dalam diagnosis tularemia. Evaluasi kemampuan Western blot dalam mendeteksi antibodi terhadap F. tularensis menunjukkan sensitivitas hampir 100% dan spesifisitas 99,6%.

deteksi kolorimetri

Metode deteksi kolorimetri bergantung pada inkubasi Western blot dengan substrat yang berinteraksi dengan enzim pelapor (seperti peroksidase) yang terikat pada antibodi sekunder. Ini mengubah pewarna yang larut menjadi bentuk tidak larut dengan warna berbeda, yang mengendap di sebelah enzim dan dengan demikian mewarnai membran. Perkembangan bercak kemudian dihentikan dengan pencucian pewarna yang larut. Kadar protein dinilai menggunakan densitometri (sebagai titik intens) atau spektrofotometri.

Deteksi chemiluminescent

Metode deteksi chemiluminescent bergantung pada inkubasi Western blot dengan substrat, yang akan bersinar ketika terkena antibodi sekunder pelapor. Cahaya tersebut kemudian dideteksi oleh kamera CCD, yang menangkap gambar digital pada Western blot atau film fotografi. Penggunaan film untuk deteksi Western blot secara bertahap menghilang karena kurangnya linearitas gambar (kuantifikasi tidak akurat). Gambar dianalisis menggunakan densitometri, yang mengevaluasi jumlah relatif pewarnaan protein dan mengukur hasilnya dalam hal kepadatan optik. Perangkat lunak berikut memungkinkan analisis data lebih lanjut, seperti analisis berat molekul, jika standar yang sesuai digunakan.

Apa itu Western blotting?

Identifikasi protein dalam campuran kompleks atau ekstrak berbagai jaringan merupakan salah satu masalah yang sering dihadapi. Dengan menggunakan alat seperti antibodi spesifik, protein yang diteliti dapat ditentukan dengan waktu dan biaya finansial yang minimal.

Pada metode Western blotting, pada tahap pertama, campuran protein dipisahkan secara elektroforesis dengan adanya natrium dodesil sulfat (SDS), kemudian dipindahkan ke membran nitroselulosa dengan cara elektroblotting. Inti dari metode ini adalah setelah elektroforesis gel ditempatkan pada membran nitroselulosa di antara lapisan kertas saring. “Sandwich” yang dirangkai dengan cara ini ditempatkan dalam medan listrik sehingga kompleks protein-SDS bergerak melintasi pelat gel dan tidak bergerak (sebagai akibat dari penyerapan nonspesifik) pada permukaan membran nitroselulosa.

Pengikatan kompleks protein-SDS ke membran nitroselulosa terutama melibatkan kekuatan yang bersifat listrik, dan interaksi ini bersifat multipoint dan mengarah pada “penyebaran” protein pada permukaan membran. Jadi, setelah transfer listrik, kita memperoleh replika gel pada nitroselulosa dengan protein yang terletak dengan cara yang sama seperti pada gel poliakrilamida.

Setelah elektroforesis SDS, transfer listrik dan penyerapan protein dari gel ke membran nitroselulosa, konformasi tersier protein sangat berubah, jika secara umum benar untuk membicarakan keberadaan struktur tersier untuk protein setelah perlakuan keras tersebut. Oleh karena itu, untuk deteksi imunokimia protein yang diteliti, biasanya hanya digunakan antibodi mono atau poliklonal khusus untuk daerah linier molekul protein. Antibodi spesifik untuk epitop konformasi (atau wilayah yang melibatkan kontak antarsubunit) umumnya tidak cocok untuk digunakan dalam Western blotting.

Setelah transfer protein, membran diinkubasi secara berurutan dengan antibodi spesifik terhadap protein yang diteliti, dan kemudian dengan antibodi sekunder spesifik terhadap fragmen Fc dari antibodi primer, terkonjugasi ke label enzim (atau lainnya) (Gbr. 1 A). Jika antibodi primer spesifik terhadap antigen yang diteliti terkonjugasi langsung ke label, antibodi sekunder tidak diperlukan (Gbr. 1 B). Kompleks imun yang terbentuk di lokasi lokalisasi protein yang diteliti “dimanifestasikan” menggunakan substrat kromogenik (tergantung pada jenis labelnya).

Sensitivitas dan spesifisitas metode ini sangat bergantung pada antibodi apa yang digunakan dalam penelitian. Antibodi yang digunakan harus spesifik terhadap rangkaian asam amino unik yang hanya merupakan karakteristik protein yang sedang dipelajari. Jika tidak, interaksi (terutama dalam kasus ekstrak protein kasar) antibodi dengan beberapa molekul protein mungkin terjadi, yang pada gilirannya akan menyebabkan munculnya beberapa pita berwarna pada membran. Identifikasi protein yang diteliti dalam kasus ini seringkali sulit atau bahkan tidak mungkin.

Faktor penting kedua yang perlu diingat ketika memilih antibodi adalah afinitas. Semakin tinggi afinitas antibodi yang digunakan, semakin terang dan jelas warna pita protein, semakin tinggi pula sensitivitas metode tersebut. Saat menggunakan antibodi afinitas tinggi, sensitivitas 1 ng atau bahkan lebih tinggi dapat dicapai.

Untuk memvisualisasikan hasil interaksi antara antigen dan antibodi yang terikat membran, digunakan antibodi sekunder, terkonjugasi dengan agen yang mampu menghasilkan sinyal tertentu dalam kondisi tertentu. Biasanya, enzim (peroksidase atau fosfatase) digunakan sebagai zat tersebut, produk reaksinya diwarnai dan diendapkan pada membran dalam bentuk endapan yang tidak larut. Label fluoresen juga dapat digunakan dalam metode ini.

Beras. 1. Skema pewarnaan imunokimia dari protein yang diteliti: A - menggunakan antibodi sekunder yang terkonjugasi ke label enzim; B - antibodi primer terkonjugasi langsung ke tag enzim.

Protokol:

I. Persiapan gel dan membran dan transfer listrik protein

Setelah elektroforesis, gel poliakrilamida ditempatkan dalam bak dengan blotting buffer (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glisin, 10% etanol). Dua lembar kertas saring, dipotong sesuai bentuk kaset blotting dan dibasahi dengan blotting buffer, diletakkan pada bagian kaset yang menghadap anoda. Kemudian membran nitroselulosa yang telah dibasahi sebelumnya dengan buffer yang sama ditempatkan pada kertas saring, pastikan tidak ada gelembung udara antara membran dan kertas. Gel kemudian harus ditempatkan dengan hati-hati pada membran, sekali lagi berikan perhatian khusus untuk memastikan tidak ada gelembung udara antara gel dan membran. Pembentukan sandwich diselesaikan dengan dua lapisan kertas saring yang dibasahi, yang ditempatkan pada permukaan gel (Gbr. 2). Sandwich yang dihasilkan dijepit dalam kaset dan ditempatkan di antara elektroda sehingga membran menghadap anoda.

Beras. 2. Skema transfer listrik protein ke membran.

II. Perpindahan listrik

Transfer listrik protein ke membran nitroselulosa dilakukan dalam buffer yang mengandung 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glisin, 10% etanol selama 30-50 menit pada tegangan konstan 100 V. Waktu transfer listrik tergantung pada ukuran membran. protein yang ditransfer, semakin besar proteinnya, semakin lama waktu transfer listriknya. Kualitas transfer listrik dan lokasi pita protein dinilai dengan pewarnaan membran nitroselulosa dengan larutan Ponceau S 0,3% dalam asam asetat 1%. Sebelum pewarnaan imunokimia, membran harus dicuci beberapa kali dengan larutan Tris berair basa lemah untuk menghilangkan pewarna yang terikat pada protein.

AKU AKU AKU. Pewarnaan imunokimia protein yang diimobilisasi pada membran nitroselulosa

Untuk memblokir tempat pengikatan antibodi nonspesifik, membran diinkubasi dengan pengadukan konstan pada suhu kamar selama 30 menit dalam PBST (untuk pemblokiran yang lebih baik, larutan PBST yang mengandung 10% susu bubuk skim dapat digunakan). Setelah pemblokiran, membran diinkubasi selama satu jam pada suhu kamar dengan pengadukan konstan dalam PBST yang mengandung 1-10 g/ml antibodi spesifik. Konsentrasi antibodi yang optimal dipilih secara empiris dan bergantung pada afinitas interaksi antibodi dengan antigen. Pada akhir inkubasi, cuci membran 5 kali dengan PBST dan pindahkan ke larutan antibodi sekunder yang terkonjugasi dengan peroksidase lobak. Pengenceran konjugat biasanya ditunjukkan oleh produsen pada kemasannya, atau dipilih secara empiris oleh peneliti. Inkubasi membran dalam larutan antibodi sekunder selama 1 jam sambil diaduk terus-menerus.

Setelah pencucian menyeluruh (ganti buffer minimal 5-6 kali), membran PBST dipindahkan ke larutan substrat kromogenik yang mengandung 3 mg diaminobenzidine (DAB) dan 10 μl hidrogen peroksida 30% dalam 10 ml 0,1 M Tris-HCl ,pH 7,6. Inkubasi dilakukan dengan pengadukan selama 5 – 10 menit. Setelah inkubasi dengan substrat selesai, membran harus dicuci dengan PBST, dikeringkan dengan cara blotting dengan kertas saring, dan salinan elektronik harus segera dibuat dengan memindai berwarna. Jika membran benar-benar kering, garis-garis protein yang dicat memudar dan gambar menjadi kurang cerah dan kontras.

Catatan: DAB beracun dan berpotensi karsinogen. Bekerja hanya dengan sarung tangan karet!

blotting barat

Profesor Departemen Biokimia
dan biologi molekuler,
Doktor Ilmu Kedokteran Spirina Lyudmila
Victorovna
blotting barat

Definisi. blotting barat
(Noda Barat,

analitis
metode,
digunakan untuk
definisi
spesifik
protein dalam sampel.

Definisi. Western blotting (Western blot, protein imunoblot, Western blotting)

Definisi. blotting barat
(Noda Barat,
imunoblot protein, Western blotting)
Western blot dikembangkan di laboratorium
George Stark (Stanford, Inggris)
Nama Western blot diberikan untuk teknik W..
oleh Neil Burnett dan merupakan permainan kata-kata dari
nama Southern Blotting. metode untuk menentukan DNA dikembangkan
sebelumnya Edwin Selatan

Western blotting dikembangkan di laboratorium George Stark (Stanford, UK)

Blot Barat
metode penentuan
protein
Teknik blotting selatan
penentuan DNA,
dikembangkan
sebelumnya Edwin
Selatan
noda).
Metode serupa
Penentuan RNA
disebut Utara
Blotting (Utara
noda).
Deteksi
pasca-translasi
modifikasi protein
disebut Timur
Blotting (Timur
noda).

protokol. PROTOKOL

PROTOKOL
1. Pemisahan protein
dengan elektroforesis gel SDS-PAGE/
Menggunakan elektroforesis gel
protein dipisahkan menjadi
gel poliakrilamida.
2. Pemindahan protein ke
selaput
3. Pemblokiran dan Deteksi
Mereka kemudian dideteksi dengan
menggunakan antibodi:
protein pertama kali berikatan
primer (mono- atau
poliklonal) antibodi,
yang pada gilirannya
kontak
dengan antibodi sekunder,
terkonjugasi dengan enzim
(peroksidase lobak atau
alkali fosfatase).

protokol. Western blotting dapat mendeteksi antigen dalam jumlah kurang dari 1 ng.

protokol.
Western blotting dapat mendeteksi
antigen dalam jumlah kurang dari 1 ng.
4. Visualisasi.
Tingkat tinggi
resolusi dicapai dalam
akun elektroforesis
pemisahan protein dan
kekhususan
antibodi monoklonal.
Visualisasi
protein yang menarik
dicapai oleh
melaksanakan
sesuai
reaksi biokimia dengan
pembentukan produk,
yang ditentukan
kolorimetri, chemiluminescent,
metode fluoresen
deteksi.

5. Analisis.

Jumlah protein diperkirakan dari
menggunakan densitometri.

Southern Blotting Metode ini mengidentifikasi fragmen DNA unik yang berukuran kira-kira sepersejuta ukuran genom.

DNA genom (biasanya
diekstrak dari
leukosit atau sel
buah) dipecah menjadi
potongan pendek,
pisahkan dalam agarosa
gel, dipindahkan ke
membran, lalu
mengenali
area tertentu dengan
menggunakan hibridisasi dengan
oligonukleotida
probe.

Blotting Utara

Mirip dengan Southern Blotting.
Metode ini memungkinkan kita untuk mengidentifikasi secara spesifik
mRNA dan perkirakan ukurannya.

Eastern Blotting (kelanjutan dari metode Western blotting)

Pengertian Metode Western Blotting

Metode ini didasarkan pada
kombinasi elektroforesis gel dan
imunokimia
reaksi antigen-antibodi.

"Fase padat" untuk imunoblotting

jenis bahan berpori
nitroselulosa (PVDF) dalam bentuk
pengisi dalam volume atau bentuk
lembaran atau strip datar
(strip bahasa Inggris); strip digunakan dalam
teknik seperti immunoblotting dan
imunokromatografi;
dalam bahan berpori itu penting
area yang lebih besar di mana
salah satu peserta terserap
interaksi; reagen lainnya
berdifusi melalui pori-pori.

Jenis fase padat untuk Western blotting

Persiapan sampel

Sampel dapat diambil secara keseluruhan
jaringan atau dari kultur sel. B Kain penuh
Budaya sel
dalam banyak kasus, jaringan keras
pertama dihancurkan secara mekanis
menggunakan blender (untuk
sampel volume besar), dengan
Penggilingan mekanis
menggunakan homogenizer
(volume lebih kecil), atau
pengobatan ultrasonik.
Berbagai deterjen deterjen, Penggilingan dengan homogenizer
garam dan buffer bisa
diterapkan untuk
meningkatkan lisis sel dan
pembubaran protein.
Perawatan ultrasonik
Inhibitor protease dan fosfatase sering kali
o ditambahkan untuk mencegah
membagi sampel mereka
Menggiling dalam nitrogen cair
enzim sendiri.
Sering menyiapkan tisu
dilakukan pada tingkat rendah
suhu ke
Inhibitor protease dan fosfatase
menghindari denaturasi protein.
Kondisi yang membaik
persiapan sampel
Deterjen, garam, buffer
menghomogenisasi sampel dengan mengocoknya
dalam mikrotube atau cangkir bersama dengan bola keras
Suhu rendah

Elektroforesis gel. Metode yang paling umum untuk memisahkan protein adalah elektroforesis gel poliakrilamida dengan adanya SDS menurut Lammy

Elektroforesis gel. Paling
metode umum
pemisahan protein -
elektroforesis di
gel poliakrilamida dalam
kehadiran SDS menurut Lammy

Elektroforesis gel

Elektroforesis gel
panggilan SDS
denaturasi protein
dan mendukung mereka
terdenaturasi
kondisi, untuk
penghancuran
sekunder dan
struktur tersier
protein digunakan
agen pereduksi
disulfida
koneksi

Elektroforesis gel

Subjek
analisis protein
kehadiran
dodesil sulfat
perolehan natrium
sama
negatif
mengenakan biaya apa yang dilakukannya
mungkin mereka
pembagian menjadi
ketergantungan saja
dari molekuler

Prinsip elektroforesis

Sebelumnya
protein yang terdenaturasi
dimasukkan ke dalam kantong “trek”
(trek) gel akrilamida
dengan konsentrasi rendah
(konsentrasi gel) itu
memungkinkan Anda memusatkannya
sebelum pindah ke
memisahkan gel (dengan lebih banyak
konsentrasi tinggi), dimana
pemisahan protein terjadi
tergantung pada molekulernya
massa.
Protein bermigrasi ke
medan listrik melalui
gel akrilamida ke anoda,
sedangkan proteinnya lebih kecil
ukuran bergerak lebih cepat.

Prinsip elektroforesis

Perbedaan kecepatan
promosi -
elektroforesis
mobilitas mengarah ke
pemisahan protein menjadi pita-pita.
Biasanya, salah satu dari
"jalan" yang tersisa
penanda massa molekul
(campuran protein dengan diketahui
massa).

Gel pewarna

pewarnaan protein
gel dengan pewarna
Coomassie
pewarnaan protein
gel perak
Untuk lebih sering memvisualisasikan hasil elektroforesis
Secara umum, pewarnaan protein dalam gel digunakan
Pewarna Coomassie atau perak

Dalam kebanyakan kasus, hasilnya
pemisahan elektroforesis sudah cukup
diperoleh dengan penilaian visual gel.
Namun, untuk mendapatkan data yang andal dan
dokumentasi hasil gel yang tepat
dipindai melalui transmisi menggunakan yang sangat sensitif
densitometer, yang memungkinkan Anda menentukan dengan andal
hanya posisi protein dalam gel, tetapi juga optik
kepadatan titik protein.
Warna
membran lebih banyak
andal

Analisis pemisahan elektroforesis protein, Blotting

Menggunakan aplikasi perangkat lunak khusus
Anda dapat menentukan parameter seperti
mobilitas elektroforesis protein, itu
kemurnian, jumlah protein dalam noda, dll.
Sistem chemiluminescent paling sering digunakan
deteksi protein – penggunaan film sinar-X
(Menghilangkan)
Menggunakan
perangkat lunak
aplikasi ImageJ

Penerapan sistem visualisasi untuk WB (lihat di bawah)

Analisis Pemisahan Protein Elektroforesis

Penentuan berat molekul protein yang diteliti
menyarankan perlunya mengkalibrasi gel sesuai dengan
berat molekul. Kalibrasi gel relatif terhadap
berat molekul penanda protein itu
dipisahkan secara paralel dengan sampel uji.

Pemilihan % gel penyelesaian.

konsentrasi
akrilamida menentukan
memungkinkan
kemampuan gel - dari
konsentrasi yang lebih tinggi
akrilamida, semakin baik
pemisahan
berat molekul rendah
protein. Rendah
konsentrasi
akrilamida membaik
memungkinkan
kemampuan elektroforesis gel untuk
berat molekul tinggi
Ukuran protein, kDa
%A A
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%

Transfer ke membran Untuk membuat protein dapat diakses oleh antibodi dan deteksi lebih lanjut, protein tersebut, bersama dengan strip gel, ditransfer ke membran, diekstrusi

Pindahkan ke membran
Agar protein dapat diakses oleh antibodi dan dideteksi lebih lanjut, protein tersebut digabungkan dengan strip
Gel ditransfer ke membran yang terbuat dari nitroselulosa atau PVDF.
Membran ditempatkan di atas gel,
dan tumpukan ditempatkan di atasnya
kertas saring.
Metode transfer protein
disebut electroblotting dan
menggunakan arus listrik, yang
memindahkan protein dari gel ke membran.
Protein berpindah dari gel ke
membran sambil mempertahankannya
lokasi. Sebagai akibat
proses "blotting".
protein tetap tipis
lapisan permukaan membran untuk
deteksi.
Kedua varian membran digunakan karena sifat pengikatannya yang tidak spesifik.
protein.
Pengikatan protein didasarkan pada keduanya
pada interaksi hidrofobik, jadi
dan pada elektrostatis
interaksi antara membran dan
protein.
Membran nitroselulosa lebih murah
PVDF, tapi jauh lebih rapuh dan lebih buruk
tahan terhadap aplikasi berulang
tanda.

Jenis elektroblotting

Kering
Basah
Semi kering
(semi kering)

Pewarnaan protein pada filter

Jalan
warna
Ponceau S
Kepekaan,
kuantitas
tupai
1-2µg
Nitroselulosa
+
Nilon
-
PVDF
+
di tengah-tengah
Hitam
1,5µg
+
-
+
Comasie
biru
1,5µg
+
-
+
tinta India
100ng
+
-
+
Biotinavidin
30ng
+
+
+
Koloid
emas
3ng
+
-
+
Warna
dapat dibalik
konstan, latar belakang rendah
latar belakang yang konstan dan tinggi
permanen
permanen, memudar dengan
waktu
permanen

Konfirmasi transfer protein ke filter (pewarnaan Ponceus)

Pemblokiran

Setelah dipilih
membran, antibodi dipilih
dan protein target seharusnya
tindakan akan diambil untuk
menghindari interaksi
antara membran dan
antibodi yang digunakan untuk
deteksi protein target (karena
antibodi itu sendiri adalah protein).
Pemblokiran
ikatan nonspesifik
dicapai oleh ruangan
membran dalam encer
larutan protein - biasanya ini
whey sapi
albumin atau kurus
susu bubuk atau gelatin
dengan persentase kecil
jenis deterjen Tween-20.
Pemblokiran adalah salah satunya
tahapan penting
melaksanakan
Barat yang efektif
noda

Mekanisme penguncian

Protein
dari encer
solusi terlampir
membran di semua tempat,
dimana target tidak terpasang
protein. Oleh karena itu, kapan
menambahkan antibodi
(antibodi) tidak ada yang gratis
tempat di membran, dimanapun
mereka bisa melampirkan
kecuali untuk situs pengikatan
sasaran tertentu
tupai Latar belakang ini
"kebisingan" di final
Produk western blot
mengarah ke bersih
hasil dan
tidak termasuk salah

Deteksi. WB tidak langsung dan langsung

keuntungan
Antibodi sekunder memperkuat sinyal (beberapa antibodi sekunder
antibodi dapat berikatan dengan satu primer)
Berbagai macam antibodi sekunder tersedia
Satu antibodi sekunder dapat digunakan
deteksi berbagai antibodi spesifik
tidak mengikat tag enzimatik dari antibodi sekunder
mempengaruhi imunoreaktivitas antibodi primer
Mengganti antibodi sekunder dapat berkontribusi terhadap perubahan
metode deteksi
kekurangan
Antibodi sekunder mendorong pembentukan situs
pengikatan nonspesifik
Langkah kerja tambahan
keuntungan
perlu menggunakan saja
antibodi primer, yang mempercepat prosesnya
kemampuan untuk menggunakan primer
antibodi dengan label berbeda
Kekurangan
mengikat tag enzimatik
dapat mengurangi imunoreaktivitas
antibodi primer
tingginya biaya antibodi primer
masalah pemilihan antibodi dan rendah
sinyal

Deteksi. Langkah selanjutnya adalah reaksi pengikatan protein yang diteliti dengan antibodi spesifik (primer).

Larutan dan membran antibodi
dapat ditutup bersama dan
diinkubasi selama 30 menit
sebelum berangkat semalaman.
Mungkin juga demikian
diinkubasi pada
suhu yang berbeda,
dengan meningkat
suhu yang diamati
pengikatan yang lebih baik.
Setelah penghapusan
primer tidak terikat
antibodi, membran
tahan dengan sekunder
antibodi dan sesuai
dengan properti targetnya,
biasanya dipanggil dengan

Antibodi untuk Western blotting. Mekanisme deteksi.

Antibodi diperoleh dari
sumber hewani dan
kontak
mayoritas primer
antibodi. Sekunder
antibodi biasanya mengikat
alkali fosfatase atau
peroksidase lobak.
Paling
umum,
berhubungan dengan peroksidase
antibodi sekunder lobak
digunakan untuk
pemotongan
chemiluminescent
agen dan produk reaksi
menghasilkan bercahaya
radiasinya proporsional
jumlah protein.
Lembaran fotosensitif
film fotografi
ditempatkan berlawanan dengan membran
dan terkena
radiasi reaksi, menciptakan
gambar pita antibodi
aib.
Lebih murah tapi lebih sedikit
pendekatan sensitif dengan
menggunakan pewarnaan 4-kloronaftol
dicampur dengan 1% peroksida
hidrogen, yang memberi warna coklat tua,
yang terdaftar tanpa
penggunaan khusus
film fotografi.

Metode deteksi lain
antibodi sekunder
menggunakan antibodi dengan
fluorofor terikat,
yang memancarkan ke dalam
dekat inframerah
daerah (NIR). Lampu,
dipancarkan
berpendar
pewarna, permanen dan
membuat berpendar
deteksi lebih akurat dan
dengan cara yang sensitif
mengukur perbedaannya
sinyal yang dihasilkan
protein yang diberi label
antibodi, Barat
aib.

Deteksi. Metode deteksi lainnya.

Alternatif ketiga
penggunaan metode
pelacak radioaktif
sebagai pengganti enzim
berhubungan dengan sekunder
antibodi (dengan
isotop radioaktif
yodium). Metode lain
lebih aman, lebih cepat dan
Oleh karena itu, lebih murah
deteksi radioaktif
jarang digunakan.

Visualisasi.

Visualisasi
dilakukan dengan
dengan bantuan dokumentasi gel
sistem atau digital
kamera.

Presentasi film

Teknologi bebas noda

Dalam praktiknya, tidak semuanya
Orang Barat ditemukan
protein hanya dalam satu pita
pada membran.
Perkiraan Ukuran
menghitung dengan membandingkan
pita dicat dengan
penanda molekuler
massa ditambahkan pada
elektroforesis.
Prosesnya akan diulangi dengan
protein struktural,
seperti aktin atau
tubulin, mana yang tidak
berubah antara
eksperimen. Kuantitas
protein target tergantung pada
kuantitas kontrol
protein struktural antara
dalam kelompok. Teknik ini
memberikan koreksi
jumlah total protein per
membran jika terjadi kesalahan

Analisis dan presentasi hasil.

Penggunaan
perangkat lunak
Aplikasi gambar
J.
Perangkat lunak
Aplikasi BioRad

IHC
Imun
fluoresensi
Barat
noda

Penerapan metode

blotting barat
digunakan
dalam molekuler
biologi, biokimia, gen
tika dan lain-lain
ilmu pengetahuan Alam
disiplin ilmu.
Dalam kedokteran:
diagnosis HIV
(AIDS), penyakit
jeruk nipis, Helicobacter
Pylori, virus Epstein Barr

Protokol lengkap

1. elektroforesis
2. pemindahan
3. pemblokiran
4. inkubasi dengan
antibodi primer
5.mencuci
6.inkubasi dengan
antibodi sekunder
7. mencuci
8. pengolahan
chemiluminescent
sistem deteksi
9. deteksi menggunakan
film sinar-x
10. analisis

Penerapan dalam pengobatan praktis

Konfirmasi
infeksi HIV
Diagnosis penyakit yang ditularkan melalui kutu
borreliosis (penyakit Lyme)
Diagnosis penyakit antraks
Diagnosis toksoplasmosis
(T);
kelompok infeksi -
hepatitis, sifilis,
klamidia, listeriosis, dll.
(TENTANG);
rubella (kanan);
sitomegalovirus
infeksi (C);
herpes (H).
virus Epstein-Barr
Dalam hal ini, membran strip uji dilapisi dengan
hanya
secara klinis
penting
antigen
(warga asli,
sintetis atau rekombinan) dalam jumlah tertentu
Oke. Pendekatan ini digunakan untuk diferensial
mendiagnosis beberapa infeksi pada satu strip

Biasa saja.

Semua metode pementasan Barat terdiri dari langkah-langkah berikut:

1) perpindahan protein dari gel ke membran;
2) menghalangi penyerapan nonspesifik;
3) adsorpsi I-antibodi;
4) mencuci;
5) adsorpsi antibodi II;
6) mencuci;
7) pengembangan filter;

Jenis membran mana yang akan digunakan: NC atau PVDV (kata mereka yang terakhir lebih sensitif) hanya bergantung pada selera Anda. Membran NC lebih rapuh, tetapi dengan pengoperasian yang hati-hati hal ini tidak terlihat.

Intinya.

Apakah akan memangkas gel, menyisakan hanya area yang ingin Anda lihat pada gambar sebelum dipindahkan, setelah dipindahkan, atau tidak dipangkas sama sekali, tergantung keinginan Anda untuk menyelamatkan membran dan antibodi.

Bisa dilakukan dalam mandi gel.

Tapi lebih baik menerapkan semuanya sekaligus tanpa gelembung.

Atau ~3mA per strip individu.

Terkadang berguna untuk menandai posisi batas gel, lubang, dll.

Anda dapat mengontrol berapa banyak protein yang tersisa di dalam gel setelah dipindahkan dengan mewarnai gel.

Hibridisasi.

Filter harus selalu basah.

Membran PVDF kering harus dibasahi dengan metanol.

Sisi P (tempat terjadinya perpindahan) harus bersentuhan dengan larutan.

Hibridisasi dengan a/t dilakukan dalam hibridizer pada suhu 26 o C dalam silinder kecil atau tabung CF 50 ml. Volume larutan hibridisasi adalah ~3ml (minimal mungkin, tetapi agar membran tidak mengering).

Pencucian dan pengisian : dengan NT, dikocok dalam bak mandi (tutup dari jenis) V = 30-50ml.

Buang larutan atau lakukan hibridisasi di dalamnya, hanya saja jangan meneteskan a/t pekat ke filter.

Untuk isian bahan yang tidak spesifik sebaiknya menggunakan susu bubuk (BSA juga bisa, tapi kami kurang menyukainya). Kumpulan yang berbeda sedikit berbeda dalam intensitas latar belakang.

Tuang larutan hibridisasi ke dalam tabung CF 50ml, tambahkan a/t secukupnya, aduk. Letakkan filter di sepanjang dinding tabung reaksi dan letakkan di dalam hibridizer.

Jika Anda tidak mengetahui pada pengenceran apa a/ts bekerja, maka Anda harus menentukannya secara eksperimental.

Waktu interaksi dengan antibodi dapat ditambah atau dikurangi tergantung pada antibodi Anda.

Hibridisasi dilakukan dalam NaCl 0,1-0,15M; penurunan kekuatan ion menyebabkan hibridisasi nonspesifik yang kuat.

Sangat penting!!! Solusi dengan antibodi dapat digunakan beberapa kali (5-7). Cukup dibekukan setelah digunakan pada suhu -20 o C. Prosedur ini setidaknya berfungsi untuk buffer hibridisasi: 1x PBS (tanpa Mg++/Ca++), 0,3-1,0% Susu kering, Antibodi.

Ketika imunostaining setelah imunopresipitasi, latar belakang dapat dihilangkan dengan melakukan prakonjugasi antibodi sekunder ke antibodi primer.

Prosedur yang diberikan bukanlah satu-satunya. Pilihan:

1. Lakukan semuanya dengan NT pada platform berayun, hibridisasi dan pengemasan dalam kantong plastik (larutan V ~1,5ml, tergantung pada ukuran filter), cuci dalam bak mandi:
1. isian: 3% susu bubuk, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1 jam susu bubuk 0,3%, 1x PBS, antiserum;
3. cuci 3 kali x 5": 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. "II"a/t: 30" dalam 1x PBS;
5. mencuci seperti pada langkah 3.

Meskipun kandungan susu kering dalam buffer hibridisasi untuk “I” a/t jauh lebih rendah dan tidak ada sama sekali dalam buffer untuk “II” a/t, metode ini memberikan gambaran yang jelas. Rupanya kesuksesan ditentukan oleh kualitas kendaraan yang digunakan.

2. Pencucian dan pengisian dilakukan di bak mandi. Hibridisasi: letakkan sepotong parafilm (lebih besar dari membran) di atas meja, dan 0,5-1 ml larutan hibridisasi dengan a/t di atasnya. Tempatkan membran dengan sisi (P) menghadap larutan, hindari gelembung, dan tutupi bagian atasnya dengan parafilm seukuran membran. Inkubasi 1 jam.

Metode ini mengurangi volume campuran hibridisasi, namun dapat menurunkan kualitas hibridisasi.

Cahaya maksimum terjadi 4-5" setelah mengaplikasikan larutan (intensitas cahaya yang wajar dipertahankan selama 15-20").