Western blotting (Western blot, protein immunoblot, Western blotting). GPM.1.7.2.0022.15 Иммунобиологийн эмийн бүтээгдэхүүний жинхэнэ, цэвэр байдлыг Western blot аргаар тодорхойлох Уургийг тодорхойлох арга Western blot

Хөөх(Англи хэлнээс" толбо" - толбо) - NC, уураг, липидийг хатуу тулгуур, жишээлбэл, мембран руу шилжүүлэх, тэдгээрийг хөдөлгөөнгүй болгох.

Молекулуудыг ялгах аргууд:

• полиакриламид гель дэх электрофорез:
o мочевиныг нэмсэн денатурацийн нөхцөлд - нэг гинжин хэлхээний богино NA-г салгах;
o натрийн додецил сульфат (Laemmli электрофорез) нэмсэн денатурацийн нөхцөлд - уургийг молекулын жингээр ялгах;
o уугуул нөхцөлд - гурван хэмжээст бүтцийн дагуу уурагуудыг ялгах;
• изоэлектрик фокус - уурагуудыг изоэлектрик цэгээр (pI) салгахад зориулагдсан;
• хоёр хэмжээст (2D) электрофорез - уурагуудыг хоёр чиглэлд - изоэлектрик цэг ба молекулын жингээр тусгаарлах;
• агароз гель электрофорез - NC салгах:
o шугаман хэсгүүдийн уртын дагуу;
o цагираг молекулуудын "супер ороомог"-оор;
• нимгэн давхаргын хроматографи - липидийн цогцолбороос липидийг салгах.

Дамжуулах аргууд:

• молекулуудын тархалт - удаан тээвэрлэлт, ихэвчлэн липидэд ашиглагддаг;
• хялгасан судсыг хатаах - мембраныг гель дээр дарж, дээр нь шүүлтүүрийн цаас байрлуулж, дамжуулагч буфер нь гелийг чийгшүүлж, хялгасан судасны хүчний нөлөөн дор дээшилж, шүүлтүүрийн цаасыг норгож, макромолекулуудыг гель рүү шилжүүлнэ. мембран; хялгасан судсыг арилгах ажлыг дараахь байдлаар хийж болно.
o буферээр чийгшүүлсэн гель бүхий камерт - "хагас хуурай" шилжүүлэх;
o буферт гель дүрэх камерт;

• вакуум blotting - хялгасан судсыг цэвэрлэхтэй төстэй боловч шүүлтүүрийн цаасыг норгох замаар үүссэн капилляр хүчний оронд вакуум ашиглан дамжуулалтыг хурдасгадаг;
• electroblotting - цэнэглэгдсэн макромолекулуудыг мембран руу шилжүүлэх нь цахилгаан гүйдлийн нөлөөн дор явагддаг;
• Хэт ягаан туяаны цацраг эсвэл халаалтын нөлөөн дор NC-ийг мембранд "оёх" - нейлон мембран дээр эцсийн бэхэлгээ хийх;
• цэгийг арилгах (хоолойг арилгах) - дээжийг гель эсвэл TLC хавтан дээр молекулуудыг урьдчилан салгахгүйгээр шууд мембран дээр цэг эсвэл зураас хэлбэрээр түрхэнэ.

Мембраны төрлүүд:

• PVDF мембран (поливинилиден фтор);
• NC мембран (нитроцеллюлоз);
• нейлон мембран (NDT-д ашигладаг).

Мембран дээрх макромолекулуудыг тэмдэглэх, илрүүлэх аргууд:

• будах - будагч бодис (мөнгөний ионууд, Coomassie, Ponceau, etidium bromide) -ийг илэрсэн макромолекулуудтай шууд холбох;
• иммунохимийн шошго - макромолекулуудын шошго нь тэдгээртэй тусгайлан холбогддог шошготой эсрэгбиемүүдийн улмаас үүсдэг бөгөөд илрүүлэлт хийгддэг.
o дархлаа будах - эсрэгбиемүүдийг будагч бодисоор тэмдэглэж, тодорхой долгионы урттай гэрлийн шингээлтийг бүртгэдэг;
o ферментийн дархлааны шинжилгээ - эсрэгбиемүүдийг ферментээр тэмдэглэж, ферментийн урвалын (ELISA) үед үүссэн өнгөт бүтээгдэхүүний хэмжээг бүртгэдэг;
o химилюминесцент - эсрэгбиемүүдийг сурвалжлагч ферментээр тэмдэглэсэн бөгөөд энэ нь субстрат байгаа үед гэрэл цацруулж, гэрлийн ялгаралтыг бүртгэдэг.
тодорхой долгионы урт;
o флюресцент - эсрэгбие нь тодорхой долгионы урттай гэрлээр өдөөгддөг флюресцент шошготой, гэрлийн ялгаруулалтыг бүртгэдэг.
илүү урт долгионы бүс;
• цацрагийн шошго - цацрагийн шошго (радиоизотопууд) -ийг макромолекулуудад нэвтрүүлж, илрүүлэлтийг дараахь байдлаар гүйцэтгэдэг.
o autoradiography (мембран дээр гэрэл зургийн хальс түрхэх замаар);
o радио дүрслэл (цацрагийн ялгаралтыг тоон тодорхойлох, тэмдгийн харьцангуй байрлалын зургийг бүтээх);
• эрлийзжүүлэх - нэмэлт бүтэцтэй нуклейн хүчлийг тэмдэглэсэн олигонуклеотидуудтай холбох нь дүрмээр бол шошгоны цацраг эсвэл флюресценцийг бүртгэх замаар хийгддэг;
• масс спектрометр - липидийн бүтцийн шууд шинжилгээнд ашигладаг.

Бөглөх төрлүүдийн хүлээн зөвшөөрөгдсөн нэрс:

• Өмнөд толбо(Southern blotting) - дээж дэх ДНХ-ийн дарааллыг тодорхойлж, геномын ДНХ-ийн генийн хуулбарын тоог тодорхойлох аргыг санал болгосон Эдвин Саутернийн нэрээр нэрлэсэн. Мембран руу шилжүүлэхийн өмнө эндонуклеазуудыг хязгаарлах замаар дээжийг задалж, агароз гель дэх электрофорезын аргаар фракцлах замаар хийдэг. Мембраны шинжилгээг тодорхой дарааллын шошготой олигонуклеотидуудтай эрлийзжүүлэх замаар гүйцэтгэдэг;
• Хойд толбо- дээж дэх РНХ-ийн дарааллыг тодорхойлох, генийн илэрхийлэлийг судлах (мРНХ тодорхойлох). Southern blotting-тэй төстэй боловч дээжээс тусгаарлагдсан РНХ молекулуудыг эндонуклеазын задралгүйгээр шинжилдэг. Молекулын тусгаарлалтыг формальдегид (РНХ-ийг денатуратлах) нэмсэн агароз гель эсвэл мочевин нэмсэн полиакриламид гель (микроРНХ-ийн шинжилгээнд ашигладаг) хэлбэрээр гүйцэтгэдэг. Мембран дээрх РНХ молекулуудыг хөдөлгөөнгүй болгох нь вакуум дор халаах эсвэл хэт ягаан туяаны цацрагийг ашиглан "загалмай" холбосоны улмаас үүсдэг;
• Баруун толбо- Уургийн иммуноблотинг нь дээжинд байгаа тодорхой уургийг тодорхойлоход ашигладаг аналитик арга юм. Мембран руу шилжүүлэхийн өмнө полиакриламидын гель дэх уургийг салгадаг. Мембран дээрх уургийн шинжилгээг иммунохимийн аргаар хийдэг;
• хол western blotting- уураг-уургийн харилцан үйлчлэлийг тодорхойлоход ашигладаг уургийн blotting нь Western blotting-тэй төстэй боловч эсрэгбиеийн оронд судалж буй уурагтай тусгайлан холбогддог бусад уураг ашигладаг;
• Өмнөд толбо- ДНХ-тэй холбогддог уураг болон ДНХ-ийн молекул дахь уураг холбогддог газруудыг тодорхойлох - Вестний blotting-тэй төстэй боловч полиакриламидын гель дэх электрофорезийг денатуржуулсны дараа уургууд нь мочевинтай хамт натрийн додецил сульфатаас угааж, уургууд руу шилждэг. диффузын замаар нитроцеллюлозын мембран. Дээж болгон, судалж буй геномын ДНХ-ийн илүү том хэсгийг хуваах замаар олж авсан өөр өөр урттай шошготой ДНХ-ийн хэсгүүдийг ашигладаг. Дараа нь уураг-ДНХ-ийн цогцолбор бүрээс холбосон ДНХ молекулуудыг угааж, полиакриламидын гель электрофорезоор шинжилдэг;
• Зүүн толбо- уургийн орчуулгын дараах өөрчлөлтийг тодорхойлох (холбогдох липидүүд, гликополисахаридууд, фосфатын үлдэгдэл) - Western blotting-тэй төстэй боловч эсрэгбие нь уураг биш харин липид, гликополисахарид гэх мэт. Эсрэгбиемүүдээс гадна туршилтын субъектуудтай холбогддог бусад уургийн молекулуудыг (жишээлбэл, лектин) дээж болгон ашигладаг;
• алс дорнодын blotting- өндөр үзүүлэлттэй нимгэн давхаргын хроматографаар тусгаарлагдсан липидийн шинжилгээ. Мембран руу шилжүүлэх нь ихэвчлэн тархалтаар явагддаг. Бүртгэлийг шууд масс спектрометрийн бүтцийн шинжилгээгээр гүйцэтгэдэг.

Баруун толбо(заримдаа дууддаг иммуноблот уурагсонсох)) нь молекул биологи, иммуногенетик болон бусад молекул биологийн салбаруудад эдийн нэгэн төрлийн эсвэл хандны дээж дэх тодорхой уургийг тодорхойлоход өргөн хэрэглэгддэг аналитик арга юм.

Товчхондоо, дээжийг уургийн денатураци, дараа нь гель электрофорез хийдэг. Үүсгэсэн синтетик эсвэл амьтны гаралтай эсрэгбие (анхдагч эсрэгбие гэж нэрлэдэг) нь тодорхой зорилтот уургийг таньж, холбогддог. Илүүдэл эсрэгбиемийг угаахын өмнө электрофорезын мембраныг анхдагч эсрэгбие агуулсан уусмалд угаана. Анхдагч эсрэгбиемийг таньж, холбодог хоёрдогч эсрэгбиемийг нэмдэг. Хоёрдогч эсрэгбиемийг будах, иммунофлуоресценц, цацраг идэвхт гэх мэт янз бүрийн аргуудыг ашиглан дүрслэн үзүүлж, тодорхой зорилтот уургийг шууд бусаар илрүүлэх боломжийг олгодог.

Бусад холбогдох аргууд нь цэгийн шинжилгээ, тоон цэгийн шинжилгээ, иммуногистохими, иммуноцитохими ба эд эс болон дархлааны шошготой эсүүд дэх уургийг илрүүлэхэд эсрэгбие ашигладаг ба ферменттэй холбоотой иммуносорбент шинжилгээ (ELISA).

Нэр баруун - толбоЭнэ бол өмнө нь Эдвин Саутерны бүтээсэн ДНХ илрүүлэх арга болох Southern blot хэмээх нэртэй нэртэй жүжиг юм. Нэмж дурдахад, РНХ илрүүлэхийг хойд толбо гэж нэрлэдэг бөгөөд Стэнфордын Жэймс Алвайн, Дэвид Кемп, Жорж Старк нар боловсруулсан. "Western blot" гэсэн нэр томъёог В.Нил Бернетт энэ техникт өгсөн боловч энэ арга нь өөрөө Харри Тоубины лабораторид үүссэн.

Хэрэглээ

Western blot нь биохимид нэг уураг, уургийн өөрчлөлтийг чанарын хувьд тодорхойлоход өргөн хэрэглэгддэг (жишээлбэл, орчуулгын дараах өөрчлөлт). Энэ нь уургийн нийлмэл холимогт тодорхой нэг уураг байгаа эсэхийг тодорхойлох ерөнхий арга болгон ашигладаг. Блотын мембран дээрх уургийн туузны хэмжээ, өнгөний эрчмээс уургийн хагас тоон тооцоог гаргаж болно. Нэмж дурдахад уургийн концентрацийг илүү нарийвчлалтай тооцоолохын тулд тодорхой концентрацитай цэвэршүүлсэн уургийн цуваа шингэрүүлэлтийг ашиглаж болно. Western blot нь клончлолын дараа уургийн үйлдвэрлэлийг шалгахад ихэвчлэн ашиглагддаг. Үүнийг мөн ХДХВ-ийн шинжилгээ эсвэл BSE-TEST гэх мэт эмнэлгийн оношлогоонд ашигладаг.

ХДХВ-ийн халдварыг баталгаажуулах тест нь хүний ​​ийлдэс дэх ХДХВ-ийн эсрэг эсрэгбиемийг илрүүлэхийн тулд Western blot ашигладаг. Мэдэгдэж буй ХДХВ-ийн халдвартай эсүүдээс уурагуудыг салгаж, дээр дурдсанчлан мембран дээр хэрэглэнэ. Туршилтын ийлдсийг дараа нь үндсэн эсрэгбиеийн инкубацийн үе шатанд хэрэглэнэ; чөлөөт эсрэгбиемийг угааж, ферментийн дохиотой хосолсон хүний ​​эсрэг хоёрдогч эсрэгбие нэмнэ. Дараа нь өнгөт туузууд нь өвчтөний ийлдэс нь эсрэгбие агуулсан уурагуудыг харуулдаг.

Баруун толбо нь үхрийн хөвөн хэлбэрийн энцефалопати (BSE, ихэвчлэн "галзуу үнээний өвчин" гэж нэрлэдэг) бүхий үхрийн бохирдсон үхрийн махыг хэрэглэхтэй холбоотой Крейцфельдт-Якоб өвчний нэг төрөл болох прион өвчний эцсийн шинжилгээ болгон ашигладаг.

Өөр нэг хэрэглээ бол туляремийн оношлогоо юм. Western blot-ийн F. tularensis-ийн эсрэг эсрэгбие илрүүлэх чадварыг үнэлэхэд түүний мэдрэмж бараг 100%, өвөрмөц чанар нь 99.6% байсан.

колориметрийн илрүүлэлт

Колориметрийн илрүүлэх арга нь хоёрдогч эсрэгбиемтэй холбогддог сурвалжлагч ферменттэй (пероксидаза гэх мэт) харилцан үйлчилдэг субстраттай барууны толбоны инкубациас хамаарна. Энэ нь уусдаг будгийг өөр өнгөтэй уусдаггүй хэлбэр болгон хувиргадаг бөгөөд энэ нь ферментийн хажууд тунадасжиж, улмаар мембраныг өнгө болгодог. Дараа нь уусдаг будгийг уусгах замаар толбо үүсэхийг зогсооно. Уургийн түвшинг денситометр (эрчимтэй цэг хэлбэрээр) эсвэл спектрофотометр ашиглан үнэлэв.

Химилюминесцент илрүүлэх

Химилюминесцент илрүүлэх аргууд нь сурвалжлагчийн хоёрдогч эсрэгбиетэй харьцах үед Вестний толбыг субстратаар инкубаци хийхээс хамаардаг. Дараа нь уг гэрлийг CCD камерууд илрүүлж, дижитал зургийг Western blot эсвэл гэрэл зургийн хальсан дээр авдаг. Зургийн шугаман чанар байхгүйгээс (тодорхой тоон үзүүлэлт биш) улмаас Western blot илрүүлэхэд кино ашиглах нь аажмаар алга болж байна. Зургийг нягтралын аргаар шинжилдэг бөгөөд энэ нь уургийн будалтын харьцангуй хэмжээг үнэлж, үр дүнг оптик нягтралаар нь хэмждэг. Дараах программ хангамж нь зохих стандартыг ашигласан тохиолдолд молекул жингийн шинжилгээ гэх мэт мэдээллийн цаашдын дүн шинжилгээ хийх боломжийг олгодог.

Western blotting гэж юу вэ?

Төрөл бүрийн эд эсийн нарийн төвөгтэй хольц эсвэл ханд дахь уургийг тодорхойлох нь байнга тулгардаг бэрхшээлүүдийн нэг юм. Тодорхой эсрэгбие гэх мэт хэрэгслийг ашиглан судалж буй уургийг хамгийн бага хугацаа, санхүүгийн зардлаар тодорхойлох боломжтой.

Western blotting аргын хувьд эхний шатанд уургийн хольцыг натрийн додецил сульфат (SDS) -ийн оролцоотойгоор электрофорезоор ялгаж, дараа нь электроблотын аргаар нитроцеллюлозын мембран руу шилжүүлдэг. Энэ аргын мөн чанар нь электрофорезийн дараа гель нь шүүлтүүрийн цаасны давхаргын хооронд нитроцеллюлозын мембран дээр тавигддаг. Ийм аргаар угсарсан "сэндвич" нь цахилгаан талбарт байрладаг бөгөөд ингэснээр уураг-SDS цогцолборууд нь гель хавтангаар хөдөлж, нитроцеллюлозын мембраны гадаргуу дээр хөдөлгөөнгүй болдог (өвөрмөц бус сорбцийн үр дүнд).

Уураг-SDS цогцолборыг нитроцеллюлозын мембрантай холбох нь гол төлөв цахилгаан шинж чанартай хүчийг агуулдаг бөгөөд энэ харилцан үйлчлэл нь олон цэгт бөгөөд мембраны гадаргуу дээр уураг тархахад хүргэдэг. Тиймээс цахилгаан дамжуулалтын дараа бид полиакриламидын гельтэй ижил аргаар байрлах уураг бүхий нитроцеллюлоз дээрх гелийн хуулбарыг олж авдаг.

Ийм хатуу эмчилгээ хийсний дараа уургийн гуравдагч бүтэц байгаа талаар ярих нь ерөнхийдөө зөв бол SDS электрофорез, цахилгаан дамжуулалт, гельээс нитроцеллюлозын мембран руу уургийн сорбци хийсний дараа уургийн гуравдагч хэлбэр ихээхэн өөрчлөгддөг. Тиймээс судалж буй уургийг иммунохимийн аргаар илрүүлэхийн тулд зөвхөн уургийн молекулын шугаман бүсэд хамаарах моно- эсвэл поликлональ эсрэгбиемүүдийг ихэвчлэн ашигладаг. Конформацийн эпитопт (эсвэл дэд нэгж хоорондын контактыг хамарсан бүс нутгуудад) өвөрмөц эсрэгбие нь ерөнхийдөө Western blotting-д хэрэглэхэд тохиромжгүй байдаг.

Уураг шилжүүлсний дараа мембраныг судалж буй уургийн өвөрмөц эсрэгбиемүүдээр дараалан өсгөвөрлөж, дараа нь ферментийн (эсвэл бусад) шошготой хавсарсан анхдагч эсрэгбиемүүдийн Fc фрагментуудын өвөрмөц хоёрдогч эсрэгбиемүүд (Зураг 1 А). Судалгаанд хамрагдаж буй эсрэгтөрөгчийн өвөрмөц анхдагч эсрэгбие нь шошгон дээр шууд хавсарсан тохиолдолд хоёрдогч эсрэгбие шаардлагагүй (Зураг 1 B). Судалгаанд хамрагдсан уургийг нутагшуулах газарт үүссэн дархлааны цогцолборууд нь хромоген субстрат (шошгоны төрлөөс хамаарч) ашиглан "илэрхийлдэг".

Аргын мэдрэмж, өвөрмөц байдал нь судалгаанд ямар эсрэгбиемүүдийг ашиглахаас ихээхэн хамаардаг. Ашигласан эсрэгбие нь зөвхөн судалж буй уургийн өвөрмөц амин хүчлийн дарааллын онцлогтой байх ёстой. Үгүй бол эсрэгбие нь хэд хэдэн уургийн молекулуудтай харилцан үйлчлэлцэх (ялангуяа түүхий уургийн хандны хувьд) боломжтой бөгөөд энэ нь мембран дээр хэд хэдэн өнгийн тууз үүсэхэд хүргэдэг. Энэ тохиолдолд судалж буй уургийг тодорхойлох нь ихэвчлэн хэцүү эсвэл бүр боломжгүй байдаг.

Эсрэгбиемийг сонгохдоо анхаарах ёстой хоёр дахь чухал хүчин зүйл бол ойр дотно байдал юм. Ашигласан эсрэгбиемүүдийн хамаарал өндөр байх тусам уургийн туузууд илүү тод, тод толботой байх тусам аргын мэдрэмж өндөр болно. Өндөр наалдацтай эсрэгбиемүүдийг хэрэглэх үед 1 нг ба түүнээс дээш мэдрэмжтэй байж болно.

Мембрантай эсрэгтөрөгч ба эсрэгбиемүүдийн харилцан үйлчлэлийн үр дүнг төсөөлөхийн тулд тодорхой нөхцөлд тодорхой дохио үүсгэх чадвартай бодисуудтай хавсарсан хоёрдогч эсрэгбиемүүдийг ашигладаг. Ихэвчлэн ийм бодис болгон ферментийг (пероксидаза эсвэл фосфатаза) ашигладаг бөгөөд урвалын бүтээгдэхүүн нь өнгөт, уусдаггүй тунадас хэлбэрээр мембран дээр тунадаг. Мөн энэ аргаар флюресцент шошгыг ашиглах боломжтой.

Цагаан будаа. 1. Судалгаанд хамрагдаж буй уургийн иммунохимийн будгийн схем: A - ферментийн шошготой хавсарсан хоёрдогч эсрэгбиемүүдийг ашиглах; B - анхдагч эсрэгбие нь ферментийн шошготой шууд холбогддог.

Протокол:

I. Гель ба мембран бэлтгэх, уургийн цахилгаан дамжуулалт

Электрофорезын дараа полиакриламидын гель нь хатаах буфер (25 мМ Tris, рН 8.3, 192 мМ глицин, 10% этанол) бүхий ваннд хийнэ. Анод руу чиглэсэн кассетны хэсэгт 2 хуудас шүүлтүүрийн цаасыг тайрч, хатаах буферээр чийгшүүлсэн байна. Дараа нь ижил буферээр урьдчилан чийгшүүлсэн нитроцеллюлозын мембраныг шүүлтүүрийн цаасан дээр байрлуулж, мембран болон цаасны хооронд агаарын бөмбөлөг байхгүй эсэхийг шалгана. Дараа нь гельийг мембран дээр болгоомжтой байрлуулж, гель ба мембраны хооронд агаарын бөмбөлөг байхгүй эсэхийг дахин анхаарч үзэх хэрэгтэй. Сэндвич үүсэх нь гель гадаргуу дээр тавигдсан чийгшүүлсэн шүүлтүүрийн цаасны хоёр давхаргаар дуусгавар болно (Зураг 2). Үүссэн сэндвичийг кассетанд хавчуулж, электродуудын хооронд байрлуулж, мембран нь анод руу чиглэнэ.

Цагаан будаа. 2. Уургийг мембран руу цахилгаан дамжуулах схем.

II. Цахилгаан дамжуулалт

Нитроцеллюлозын мембран дээр уургийн цахилгаан дамжуулалтыг 25 мм Tris, рН 8.3, 192 мм глицин, 10% этанол агуулсан буферт 100 В тогтмол хүчдэлд 30-50 минутын турш явуулдаг. Цахилгаан дамжуулах хугацаа нь түүний хэмжээнээс хамаарна. шилжүүлсэн уураг, уураг их байх тусам цахилгаан дамжуулалт удаан үргэлжилнэ. Нитроцеллюлозын мембраныг 1% цууны хүчил дэх Ponceau S-ийн 0.3% уусмалаар будах замаар цахилгаан дамжуулалтын чанар, уургийн туузны байршлыг үнэлдэг. Дархлаа химийн будалт хийхээс өмнө мембраныг сул шүлтлэг усан Tris уусмалаар хэд хэдэн удаа угааж, уурагтай холбоотой будгийг арилгах хэрэгтэй.

III. Нитроцеллюлозын мембран дээр хөдөлгөөнгүй уургийн иммунохимийн будалт

Өвөрмөц бус эсрэгбиетэй холбогдох газруудыг хаахын тулд мембраныг тасалгааны температурт 30 минутын турш PBST-д тогтмол хутгах замаар өсгөвөрлөнө (илүү сайн блоклохын тулд 10% тосгүй сүүний нунтаг агуулсан PBST уусмалыг ашиглаж болно). Блоклосны дараа мембраныг тасалгааны температурт 1-10 мкг/мл өвөрмөц эсрэгбие агуулсан PBST-д тогтмол хутгах замаар нэг цагийн турш өсгөвөрлөнө. Эсрэгбиеийн оновчтой концентрацийг эмпирик байдлаар сонгож, эсрэгбиеийн эсрэгтөрөгчтэй харьцах харьцаанаас хамаарна. Инкубацийн төгсгөлд мембраныг PBST-ээр 5 удаа угааж, тунхууны пероксидазтай холбосон хоёрдогч эсрэгбиеийн уусмал руу шилжүүлнэ. Коньюгатыг шингэрүүлэхийг ихэвчлэн сав баглаа боодол дээр үйлдвэрлэгч зааж өгдөг эсвэл судлаач эмпирик байдлаар сонгодог. Мембраныг хоёрдогч эсрэгбиеийн уусмалд 1 цагийн турш байнга хутгах замаар өсгөвөрлөнө.

Бүрэн угаасны дараа (буферийг дор хаяж 5-6 удаа өөрчлөх) PBST мембраныг 10 мл 0.1 М Tris-HCl-д 3 мг диаминобензидин (DAB) ба 10 мкл 30% устөрөгчийн хэт исэл агуулсан хромоген субстратын уусмал руу шилжүүлнэ. , рН 7.6. Инкубацийг 5-10 минутын турш хутгах замаар явуулна. Субстраттай инкубаци хийж дууссаны дараа мембраныг PBST-ээр угааж, шүүлтүүрийн цаасаар хатааж, өнгөт сканнердах замаар цахим хуулбарыг нэн даруй хийнэ. Хэрэв мембран бүрэн хатаж байвал будсан уургийн судал нь бүдгэрч, зураг нь тод, тодосгогч биш болж хувирдаг.

Анхаар: DAB нь хортой бөгөөд хорт хавдар үүсгэгч бодис юм. Зөвхөн резинэн бээлийтэй ажилла!

Баруун толбо

Биохимийн тэнхимийн профессор
ба молекул биологи,
Анагаахын шинжлэх ухааны доктор Спирина Людмила
Викторовна
Баруун толбо

Тодорхойлолт. Баруун толбо
(Western blot,

аналитик
арга,
ашигласан
тодорхойлолтууд
тодорхой
дээж дэх уураг.

Тодорхойлолт. Western blotting (Western blot, protein immunoblot, Western blotting)

Тодорхойлолт. Баруун толбо
(Western blot,
уураг иммуноблот, Western blotting)
Western blot-ийг лабораторид боловсруулсан
Жорж Старк (Стэнфорд, Их Британи)
Western blot гэдэг нэрийг В.-ийн техникт өгсөн.
Нейл Бернетт бичсэн бөгөөд үгэн дээр тоглуулсан жүжиг юм
Southern Blotting гэдэг. ДНХ-ийг тодорхойлох аргуудыг боловсруулсан
хуучнаар Эдвин Саутерн

Western blotting-ийг Жорж Старкийн лабораторид (Стэнфорд, Их Британи) боловсруулсан.

Western Blotting
тодорхойлох арга
уураг
Southern blotting техник
ДНХ-ийн тодорхойлолт,
боловсруулсан
урьд нь Эдвин
Өмнөд
арилгах).
Үүнтэй төстэй арга
РНХ тодорхойлох
Хойд гэж нэрлэдэг
Blotting (Хойд
арилгах).
Илрүүлэх
орчуулгын дараах
уургийн өөрчлөлт
Дорнод гэж нэрлэдэг
Blotting (Зүүн
арилгах).

протокол. ПРОТОКОЛ

ПРОТОКОЛ
1. Уураг ялгах
SDS-PAGE гель электрофорез/
Гель электрофорез ашиглах
уураг нь хуваагддаг
полиакриламид гель.
2. Уураг руу шилжих
мембран
3. Блоклох ба илрүүлэх
Дараа нь тэдгээрийг илрүүлдэг
эсрэгбие ашиглах:
уураг нь эхлээд холбогддог
анхдагч (моно эсвэл
поликлональ) эсрэгбие,
энэ нь эргээд
холбоо барих
хоёрдогч эсрэгбиемүүдтэй,
ферментүүдтэй нэгддэг
(тунхууны пероксидаза эсвэл
шүлтлэг фосфатаза).

протокол. Western blotting нь эсрэгтөрөгчийг 1 нг-ээс бага хэмжээгээр илрүүлэх боломжтой.

протокол.
Western blotting илрүүлэх боломжтой
1нг-ээс бага хэмжээтэй антиген.
4. Дүрслэл.
Өндөр зэрэгтэй
тогтоолд хүрч байна
электрофоретик данс
уураг ялгах ба
өвөрмөц байдал
моноклональ эсрэгбие.
Дүрслэл
сонирхож буй уураг
-аар хүрсэн
хийх
тохиромжтой
бүхий биохимийн урвал
бүтээгдэхүүн үүсэх,
аль нь тодорхойлогддог
колориметрийн, химилюминесцент,
флюресцент аргууд
илрүүлэх.

5. Шинжилгээ.

Уургийн хэмжээг тооцоолно
денситометр ашиглан.

Southern Blotting Энэ арга нь геномын саяны нэг орчим хэмжээтэй ДНХ-ийн өвөрмөц хэсгүүдийг тодорхойлдог.

Геномын ДНХ (ихэвчлэн
-аас гаргаж авсан
лейкоцит буюу эсүүд
жимс) хуваагдана
богино хэсгүүд,
тэдгээрийг агарозоор тусгаарлана
гель, шилжүүлсэн
мембран, дараа нь
тодорхойлох
бүхий тодорхой газрууд
-тэй эрлийзжүүлэн
олигонуклеотид
датчик.

Хойд Blotting

Southern Blotting-тэй төстэй.
Энэ арга нь тодорхой зүйлийг тодорхойлох боломжийг бидэнд олгодог
мРНХ ба түүний хэмжээг тооцоол.

Eastern Blotting (Western blotting аргын үргэлжлэл)

Western Blotting аргын тодорхойлолт

Энэ арга нь дээр үндэслэсэн болно
гель электрофорезын хослолууд ба
иммунохимийн
эсрэгтөрөгч-эсрэгбиеийн урвал.

Дархлаажуулалтад зориулсан "хатуу фаз"

сүвэрхэг материалын төрөл
хэлбэрээр нитроцеллюлоз (PVDF)
эзэлхүүн эсвэл хэлбэрээр дүүргэгч
хавтгай хуудас эсвэл тууз
(Англи зурвас); туузыг ашигладаг
immunoblotting болон
иммунохроматографи;
сүвэрхэг материалд зайлшгүй шаардлагатай
илүү том талбай дээр
оролцогчдын нэг нь уйтгартай байна
харилцан үйлчлэл; бусад урвалжууд
нүх сүвээр дамжин тархдаг.

Western blotting-д зориулсан хатуу фазын төрлүүд

Дээж бэлтгэх

Дээжийг бүхэлд нь авч болно
эд эс эсвэл эсийн өсгөвөрөөс. B Бүрэн даавуу
Эсийн өсгөвөр
ихэнх тохиолдолд хатуу эдүүд
эхлээд механикаар буталсан
хутгагч ашиглан (нь
их хэмжээний дээж), хамт
Механик нунтаглах
нэгэн төрлийн болгогч ашиглан
(бага боть), эсвэл
хэт авианы эмчилгээ.
Төрөл бүрийн угаалгын нунтаг угаалгын нунтаг, Гомогенжуулагчаар нунтаглах
давс, буфер байж болно
хүсэлт гаргасан
эсийн задралыг сайжруулах ба
уураг уусгах.
Хэт авианы эмчилгээ
Протеаз ба фосфатазын дарангуйлагч нь ихэвчлэн байдаг
o урьдчилан сэргийлэх зорилгоор нэмдэг
тэдний дээжийг хуваах
Шингэн азотоор нунтаглах
өөрийн ферментүүд.
Эд эсийг байнга бэлдэх
бага түвшинд гүйцэтгэнэ
температур хүртэл
Протеаз ба фосфатазын дарангуйлагчид
уургийн денатурациас зайлсхийх.
Сайжрах нөхцөлүүд
дээж бэлтгэх
Угаалгын бодис, давс, буфер
дээжийг сэгсрэх замаар нэгэн төрлийн болгодог
хатуу бөмбөлөгтэй хамт бичил хоолой эсвэл аяганд хийнэ
Бага температур

Гель электрофорез. Уургийг ялгах хамгийн түгээмэл арга бол Ламмигийн дагуу SDS-ийн дэргэд полиакриламидын гель электрофорез юм.

Гель электрофорез. Ихэнх
нийтлэг арга
уураг ялгах -
электрофорез
полиакриламид гель
Ламмигийн дагуу SDS байгаа эсэх

Гель электрофорез

Гель электрофорез
SDS дуудлага
уургийн денатураци
мөн тэднийг дэмждэг
денатуратлагдсан
нөхцөл, төлөө
сүйрэл
хоёрдогч ба
гуравдагч бүтэц
уураг хэрэглэдэг
бууруулах бодисууд
дисульфид
холболтууд

Гель электрофорез

Сэдэв
уургийн шинжилгээ
оршихуй
додецил сульфат
натрийн нэмэгдэл
адилхан
сөрөг
юу хийдэгийг цэнэглэнэ
боломжтой
хуваах
зөвхөн хамаарал
молекулаас

Электрофорезын зарчим

Өмнө нь
денатурат уургууд
"зам" -ын халаасанд хийх
(замууд) акриламидын гель
бага концентрацитай
(баяжуулагч гель) тэр
тэдгээрийг төвлөрүүлэх боломжийг танд олгоно
руу шилжихээс өмнө
салгах гель (илүү их
өндөр концентраци), хаана
уургийн ялгарал үүсдэг
молекулаас хамаарна
масс.
Уургууд руу шилжинэ
дамжуулан цахилгаан орон
анод руу акриламидын гель,
харин уураг нь бага байдаг
хэмжээ илүү хурдан хөдөлдөг.

Электрофорезын зарчим

Хурдны ялгаа
урамшуулал -
электрофорез
хөдөлгөөнт байдал нь хүргэдэг
уурагуудыг тууз болгон хуваах.
Дүрмээр бол нэг нь
"замууд" үлдсэн байна
молекул массын маркерууд
(мэдэгдэж байгаа уургийн холимог
масс).

Өнгө будах гель

уургийн будалт
будагтай гель
Кумасси
уургийн будалт
мөнгөн гель
Электрофорезын үр дүнг илүү олон удаа төсөөлөхийн тулд
Ерөнхийдөө гель дэх уургийг будах аргыг хэрэглэдэг
Coomassie будаг эсвэл мөнгө

Ихэнх тохиолдолд үр дүн гардаг
электрофорезоор тусгаарлах нь хангалттай
гелийн харааны үнэлгээгээр олж авсан.
Гэсэн хэдий ч найдвартай мэдээлэл олж авахын тулд болон
гель үр дүнгийн зохих баримт бичиг
маш мэдрэмтгий ашиглан дамжуулалтаар сканнердсан
нягт хэмжигч, энэ нь танд найдвартай тодорхойлох боломжийг олгодог
зөвхөн гель дэх уургийн байрлал, бас оптик
уургийн цэгийн нягтрал.
Өнгө будах
мембран илүү
найдвартай

Уургийн электрофорез ялгах шинжилгээ, Blotting

Тусгай програм хангамж ашиглах
зэрэг параметрүүдийг тодорхойлж болно
уургийн электрофорезийн хөдөлгөөн, түүний
цэвэр байдал, толбо дахь уургийн хэмжээ гэх мэт.
Химилюминесцент системийг ихэвчлэн ашигладаг
уураг илрүүлэх - рентген хальс ашиглах
(Blotting)
Ашиглах
програм хангамж
ImageJ програм

ДБ-д зориулсан дүрслэлийн системийн хэрэглээ (доороос үзнэ үү)

Электрофоретик уураг ялгах шинжилгээ

Судалж буй уургийн молекулын жинг тодорхойлох
дагуу гель тохируулах шаардлагатайг санал болгож байна
молекулын жин. -тэй харьцуулахад гелийг тохируулна
уургийн маркеруудын молекул жин гэж
туршилтын дээжтэй зэрэгцүүлэн тусгаарлана.

Шийдэх % гель сонгох.

төвлөрөл
акриламид тодорхойлдог
зөвшөөрөх
гель чадвар - илүү
өндөр концентраци
акриламид, илүү сайн
тусгаарлах
бага молекул жинтэй
уураг. Бага
төвлөрөл
акриламид сайжирна
зөвшөөрөх
гель электрофорез хийх чадвар
өндөр молекул жинтэй
Уургийн хэмжээ, кДа
%AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%

Мембран руу шилжүүлэх Уургийг эсрэгбиемүүдэд хүртээмжтэй болгох, цаашид илрүүлэхийн тулд тэдгээрийг гель туузны хамт мембран руу шилжүүлж, шахаж авдаг.

Мембран руу шилжүүлэх
Уургийг эсрэгбие болон цаашдын илрүүлэлтэд бэлэн болгохын тулд тэдгээрийг туузтай хослуулдаг
Гель нь нитроцеллюлоз эсвэл PVDF-ээс бүрдсэн мембран руу шилждэг.
Мембраныг гель дээр байрлуулна.
мөн дээр нь стек байрлуулсан байна
шүүлтүүрийн цаас.
Уураг дамжуулах арга
electroblotting гэж нэрлэдэг ба
цахилгаан гүйдэл ашигладаг бөгөөд энэ нь
гельээс уурагуудыг мембран руу шилжүүлдэг.
Уургууд нь гель рүү шилждэг
мембраныг хадгалахын зэрэгцээ
байршил. Үр дүнд нь
"блотинг" үйл явц
уураг нь нимгэн байдаг
хувьд мембраны гадаргуугийн давхарга
илрүүлэх.
Өвөрмөц бус холбох шинж чанараас шалтгаалан мембраны хоёр хувилбарыг хоёуланг нь ашигладаг.
уураг.
Уураг холбох нь хоёуланд нь суурилдаг
гидрофобик харилцан үйлчлэл дээр, тиймээс
ба электростатик дээр
мембран хоорондын харилцан үйлчлэл ба
уураг.
Нитроцеллюлозын мембран хямд байдаг
PVDF, гэхдээ илүү эмзэг, илүү муу
давтан хэрэглэхийг тэсвэрлэдэг
тэмдэг.

Электроблотын төрлүүд

Хуурай
Нойтон
Хагас хуурай
(хагас)

Шүүлтүүр дээр уургийн будалт

Арга зам
будах
Понсо С
Мэдрэмж,
тоо хэмжээ
хэрэм
1-2 мкг
Нитроцеллюлоз
+
Нейлон
-
PVDF
+
Амидо
Хар
1.5 мкг
+
-
+
Комасси
цэнхэр
1.5 мкг
+
-
+
Энэтхэг бэх
100нг
+
-
+
Биотинавидин
30нг
+
+
+
Коллоид
алт
3нг
+
-
+
Өнгө будах
буцаах боломжтой
тогтмол, бага дэвсгэр
тогтмол, өндөр дэвсгэр
байнгын
байнгын, хамт бүдгэрдэг
цаг
байнгын

Шүүлтүүр рүү уураг шилжүүлсэнийг баталгаажуулах (Понсесын толбо)

Блоклох

Нэгэнт сонгосон
мембран, сонгосон эсрэгбие
болон зорилтот уураг байх ёстой
арга хэмжээ авна
харилцан үйлчлэлээс зайлсхийх
мембраны хооронд ба
эсрэгбие хэрэглэдэг
зорилтот уураг илрүүлэх (учир нь
эсрэгбие нь өөрөө уураг юм).
Блоклох
өвөрмөц бус холболтууд
өрөөнд хүрсэн
шингэрүүлсэн мембранууд
уургийн уусмал - ихэвчлэн энэ
үхрийн шар сүү
альбумин эсвэл туранхай
хуурай сүү эсвэл желатин
бага хувьтай
Tween-20 төрлийн угаалгын нунтаг.
Блоклох нь нэг юм
чухал үе шатууд
хийх
үр дүнтэй баруун
толбо

Түгжих механизм

Уураг
шингэлсэнээс
уусмалыг хавсаргав
бүх газарт мембран,
зорилго хавсаргаагүй газар
уураг. Тиймээс, хэзээ
эсрэгбие нэмэх
(эсрэгбие) үнэгүй гэж байдаггүй
мембран дээр хаана ч байсан байрлуулна
тэд хавсаргаж болно
дээр холбохоос бусад
тодорхой зорилт
хэрэм Энэ дэвсгэр
финалд "шуугиан"
Western blot бүтээгдэхүүн
цэвэрлэхэд хүргэдэг
үр дүн ба
худлааг эс тооцвол

Илрүүлэх. Шууд болон шууд ДБ

давуу тал
Хоёрдогч эсрэгбие нь дохиог нэмэгдүүлдэг (хэд хэдэн хоёрдогч
эсрэгбие нь нэг анхдагчтай холбогдож болно)
Хоёрдогч эсрэгбиеийн өргөн хүрээтэй
Нэг хоёрдогч эсрэгбиемийг ашиглаж болно
янз бүрийн өвөрмөц эсрэгбие илрүүлэх
Хоёрдогч эсрэгбиеийн ферментийн шошготой холбогддоггүй
анхдагч эсрэгбиеийн дархлааны идэвхжилд нөлөөлдөг
Хоёрдогч эсрэгбиемийг солих нь өөрчлөлтөд хувь нэмэр оруулж болно
илрүүлэх арга
дутагдал
Хоёрдогч эсрэгбие нь сайт үүсэхийг дэмждэг
өвөрмөц бус холболт
Ажлын нэмэлт алхамууд
давуу тал
зөвхөн ашиглах хэрэгтэй
анхдагч эсрэгбие, энэ нь үйл явцыг хурдасгадаг
анхан шатны ашиглах чадвар
өөр өөр шошготой эсрэгбие
Алдаа дутагдал
ферментийн шошготой холбох
дархлаа бууруулж болзошгүй
анхдагч эсрэгбие
анхдагч эсрэгбиеийн өндөр өртөг
эсрэгбие сонгох асуудал ба бага
дохио

Илрүүлэх. Дараагийн алхам бол судалж буй уургийг тодорхой эсрэгбиемтэй (анхдагч) холбох урвал юм.

Эсрэгбиеийн уусмал ба мембран
хамт хааж болно ба
30 минутын турш өсгөвөрлөнө
шөнө явахын өмнө.
Тэд бас байж болно
-д инкубацлагдсан
өөр өөр температур,
нэмэгдсэнтэй
температур ажиглагдсан
илүү сайн холбох.
Арилгасны дараа
холбоогүй анхдагч
эсрэгбие, мембран
хоёрдогчтой тэсвэрлэх
эсрэгбие ба дагуу
зорилтот шинж чанараараа,
ихэвчлэн дууддаг

Western blotting эсрэгбие. Илрүүлэх механизм.

Эсрэгбиемүүдийг эндээс авдаг
амьтны эх үүсвэр ба
холбоо барих
анхан шатны ихэнх
эсрэгбие. Хоёрдогч
эсрэгбие нь ихэвчлэн холбогддог
шүлтлэг фосфатаза буюу
тунхууны пероксидаз.
Ихэнх
нийтлэг,
пероксидазатай холбоотой
тунхууны хоёрдогч эсрэгбие
ашигласан
огтлох
химилюминесцент
бодис ба урвалын бүтээгдэхүүн
гэрэлтэгч үүсгэдэг
цацраг пропорциональ байна
уургийн хэмжээ.
Хуудас гэрэлд мэдрэмтгий
гэрэл зургийн хальс
мембраны эсрэг талд байрлуулсан
болон өртөж байна
урвалын цацраг, үүсгэх
эсрэгбиеийн туузны дүрс
толбо.
Илүү хямд боловч бага
-тэй мэдрэмжтэй хандах
4-хлоронафтол будах аргыг ашиглан
1% хэт исэлтэй холино
хар хүрэн өнгө өгдөг устөрөгч,
ямар ч бүртгэлгүй
тусгай хэрэглээ
гэрэл зургийн хальс.

Өөр нэг илрүүлэх арга
хоёрдогч эсрэгбие
-тэй эсрэгбие хэрэглэдэг
холбогдсон флюрофор,
дотор нь ялгардаг
хэт улаан туяаны ойролцоо
талбай (NIR). Гэрэл,
ялгарсан
флюресцент
будаг, байнгын болон
флюресцент болгодог
илрүүлэх нь илүү нарийвчлалтай ба
мэдрэмжтэй байдлаар
ялгааг хэмжих
дохио үйлдвэрлэсэн
шошготой уураг
эсрэгбие, Баруун
толбо.

Илрүүлэх. Бусад илрүүлэх аргууд.

Гурав дахь хувилбар
аргыг ашигладаг
цацраг идэвхт илрүүлэгч
ферментийн оронд
хоёрдогчтой холбоотой
эсрэгбие (хамт
цацраг идэвхт изотоп
иод). Бусад аргууд
илүү аюулгүй, хурдан,
хямд, тиймээс
цацраг идэвхт илрүүлэлт
ховор хэрэглэгддэг.

Дүрслэл.

Дүрслэл
хамтран гүйцэтгэсэн
гель баримт бичгийн тусламжтайгаар
систем эсвэл дижитал
камер.

Кино танилцуулга

Толбогүй технологи

Практик дээр бүх зүйл биш
Барууныхан нээсэн
зөвхөн нэг туузан дахь уураг
мембран дээр.
Ойролцоогоор хэмжээ
харьцуулах замаар тооцоолно
бүхий өнгөт хамтлагууд
молекулын маркерууд
масс нэмсэн
электрофорез.
Процесс нь давтагдах болно
бүтцийн уураг,
актин эсвэл гэх мэт
тубулин нь тийм биш юм
хооронд солих
туршилтууд. Тоо хэмжээ
зорилтот уураг хамаарна
хяналтын тоо хэмжээ
хооронд бүтцийн уураг
бүлгүүдэд. Энэ техник
залруулга өгдөг
ногдох нийт уургийн хэмжээ
алдаа гарсан тохиолдолд мембран

Үр дүнгийн дүн шинжилгээ, танилцуулга.

Хэрэглээ
програм хангамж
Зургийн програмууд
Ж.
Програм хангамж
BioRad програм

IHC
Дархлаатай
флюресцент
Баруун
толбо

Аргын хэрэглээ

Баруун толбо
ашигласан
молекулын хувьд
биологи, биохими, ген
тика болон бусад
байгалийн шинжлэх ухаан
салбарууд.
Анагаах ухаанд:
ХДХВ-ийн халдварын оношлогоо
(ДОХ), өвчин
шохой, Хеликобактер
Пилори, Эпштейн Барр вирус

Бүрэн протокол

1. электрофорез
2. шилжүүлэх
3. хаах
4. хамт өсгөвөрлөх
анхдагч эсрэгбие
5.угаах
6. инкубаци хийх
хоёрдогч эсрэгбие
7. угаах
8. боловсруулах
химилюминесцент
илрүүлэх систем
9. ашиглан илрүүлэх
рентген хальс
10. шинжилгээ

Практик анагаах ухаанд хэрэглэх

Баталгаажуулалт
ХДХВ-ийн халдвар
Хачигт халдварын оношлогоо
боррелиоз (Лаймын өвчин)
Боом өвчний оношлогоо
Токсоплазмозын оношлогоо
(T);
халдварын бүлэг -
гепатит, тэмбүү,
хламиди, листериоз гэх мэт.
(ТУХАЙ);
улаанууд (R);
цитомегаловирус
халдвар (C);
герпес (H).
Эпштейн-Барр вирус
Энэ тохиолдолд туршилтын туузны мембраныг бүрсэн байна
зөвхөн
эмнэлзүйн хувьд
чухал ач холбогдолтой
эсрэгтөрөгч
(уугуул,
синтетик буюу рекомбинант) тодорхой хэмжээнд
болж байна уу. Энэ аргыг дифференциалд ашигладаг
нэг туузан дээр олон халдварыг оношлох

Нийтлэг байдаг.

Барууны үе шатны бүх аргууд нь дараах алхмуудаас бүрдэнэ.

1) уураг гельээс мембран руу шилжүүлэх;
2) өвөрмөц бус сорбцийг хаах;
3) I-эсрэгбиеийн шингээлт;
4) угаах;
5) II-эсрэгбиеийн шингээлт;
6) угаах;
7) шүүлтүүр боловсруулах;

Ямар төрлийн мембраныг ашиглах вэ: NC эсвэл PVDV (тэд сүүлийнх нь илүү мэдрэмтгий гэж хэлдэг) зөвхөн таны амтаас хамаарна. Сүлжээний сүлжээний мембран нь илүү эмзэг боловч болгоомжтой ажиллахад энэ нь мэдэгдэхүйц биш юм.

Оноо.

Шилжүүлгийн өмнө, шилжүүлсний дараа зөвхөн зурган дээр харахыг хүссэн хэсгийг нь үлдээж, гель тайрах уу, эсвэл огт тайрахгүй байх нь таны мембран болон эсрэгбиемийг хадгалах хүсэл эрмэлзлээс хамаарна.

Гель ваннд хийж болно.

Гэхдээ бөмбөлөггүйгээр бүгдийг нэг дор түрхэх нь дээр.

Эсвэл нэг зурвас тутамд ~3мА.

Заримдаа гельний хил хязгаар, худаг гэх мэт байрлалыг тэмдэглэх нь ашигтай байдаг.

Шилжүүлсний дараа гельд хэр хэмжээний уураг үлдэхийг гелийг будах замаар хянах боломжтой.

Гибридизаци.

Шүүлтүүр нь үргэлж нойтон байх ёстой.

Хатаасан PVDF мембраныг метанолоор норгох ёстой.

P тал (шилжүүлэлт хийгдсэн) уусмалтай харьцах ёстой.

A/t-тай эрлийзжүүлэлт нь жижиг цилиндр эсвэл 50 мл CF хуруу шилэнд 26 o C температурт эрлийзжүүлэгчид хийгддэг. Гибридизацийн уусмалын эзэлхүүн нь ~3мл (хамгийн бага боловч мембран хатахгүйн тулд).

Угаах, дүүргэх: NT-тай, ваннд сэгсрэх (төрлөөс нь таг) V = 30-50 мл.

Уусмалыг хая эсвэл түүнд эрлийзжүүлээрэй, зүгээр л шүүлтүүр дээр концентрацитай а/т дусааж болохгүй.

Өвөрмөц бус материалыг дүүргэхийн тулд хуурай сүү хэрэглэх нь хамгийн сайн арга юм (BSA бас боломжтой, гэхдээ бидэнд бага таалагддаг). Өөр өөр багцууд нь арын эрч хүчээр бага зэрэг ялгаатай байдаг.

Гибридизацийн уусмалыг 50 мл CF хоолойд хийнэ, шаардлагатай хэмжээний а/т нэмээд холино. Шүүлтүүрийг туршилтын хоолойн ханын дагуу байрлуулж, гибридизерт хийнэ.

Хэрэв та а/ц ямар шингэрүүлэлтээр ажилладагийг мэдэхгүй бол үүнийг туршилтаар тодорхойлох хэрэгтэй.

Эсрэгбиемүүдтэй харьцах хугацааг таны эсрэгбиемээс хамаарч нэмэгдүүлж эсвэл багасгаж болно.

Гибридизаци нь 0.1-0.15M NaCl-д явагддаг; ионы хүч буурах нь өвөрмөц бус эрлийзжилтийг үүсгэдэг.

Маш чухал!!!Эсрэг биетүүдтэй уусмалыг хэд хэдэн удаа (5-7) хэрэглэж болно. Хэрэглэсний дараа -20 хэмд хөлдөөхөд хангалттай. Энэ процедур нь хамгийн багадаа гибридизацийн буферт ажилладаг: 1x PBS (Mg++/Ca++ агуулаагүй), 0.3-1.0% Хуурай сүү, Эсрэгбие.

Дархлаа тунадасжилтын дараа дархлаажуулалт хийх үед хоёрдогч эсрэгбиемүүдийг анхдагч эсрэгбиетэй урьдчилан нэгтгэх замаар дэвсгэрийг арилгаж болно.

Өгөгдсөн журам нь цорын ганц биш юм. Сонголтууд:

1. NT-тэй бүх зүйлийг дүүжин тавцан дээр хийж, эрлийзжүүлж, гялгар уутанд хийж (V уусмал ~1.5 мл, шүүлтүүрийн хэмжээнээс хамаарч) ваннд угаана.
1. дүүргэх: 3% хуурай сүү, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1цаг 0.3% хуурай сүү, 1x PBS, антисерум;
3. 3 удаа x 5" угаах: 1x PBS, 0.05% Tween-20;
4. 1x PBS-д "II"a/t: 30";
5. 3-р алхамын дагуу угаах.

“I” a/t-ийн эрлийзжүүлэлтийн буфер дэх хуурай сүүний агууламж мэдэгдэхүйц бага, “II” a/t-ийн буферт бүрэн байхгүй байсан ч энэ арга нь тодорхой дүр зургийг харуулсан. Амжилт нь ашигласан тээврийн хэрэгслийн чанараар тодорхойлогддог бололтой.

2. Угаах, дүүргэх ажлыг ваннд хийдэг. Гибридизаци: Ширээн дээр парафилм (мембранаас том) хэсгийг тавьж, дээр нь 0.5-1 мл эрлийзжүүлэх уусмалыг а/т хийнэ. Мембраныг бөмбөлөг үүсэхээс сэргийлж уусмал руу харсан тал руу нь (P) байрлуулж, дээд талыг нь мембраны хэмжээтэй парафилмээр бүрхэнэ. 1 цаг өсгөвөрлөнө.

Энэ арга нь эрлийзжүүлсэн хольцын эзэлхүүнийг багасгах боловч эрлийзжүүлэлтийн чанарыг муутгаж болно.

Уусмалыг хэрэглэсний дараа хамгийн их гэрэлтэх нь 4-5 инч (гэрэлтийн боломжийн эрчмийг 15-20 инч хүртэл хадгална).